摘要
探究矿物源黄腐酸（MFA）、生化源黄腐酸（BFA）和秸秆源黄腐酸（SFA）的结构差异，为黄腐酸在农业生产中的应用提供合理依据。采用元素分析仪（EA）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶红外光谱（FTIR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）、三维荧光光谱（3D-EEMs）和气相色谱-质谱联用（GC/MS）等技术，研究不同类型黄腐酸的元素组成、官能团种类、化学结构特征及化合物组成。元素组成显示，SFA 中 O、S、N、H 元素含量均高于 MFA 和 BFA，且具有较高的 H/C、O/C、N/C 和（N+O）/C。采用 UV-Vis 和 FTIR 发现，与 MFA 相比，BFA 和 SFA 的芳香性较弱，芳香环上的含氧官能团较多，分子量较小，聚合度程度低。采用 13C-NMR 表明，3 类黄腐酸的碳结构均以烷氧基碳和芳香碳占比为主，但 SFA 的疏水性指数、芳香缩合程度低于 MFA 和 BFA。采用 3D-EEMs 显示，3 类黄腐酸在组成物质上均以羰基、羧基和酚类结构的含氧类物质为主，其中 SFA 和 BFA 的羧基、羰基和酚类结构占比较大，而 MFA 的芳香性结构则较多。采用 GC/MS 发现，MFA、BFA 和 SFA 分别由 84、93 和 101 种化合物组成，且均以含氧化合物为主，其占比分别为 89.89%、92.80% 和 86.28%，而含氮化合物则是 SFA 高于 MFA 和 BFA。总之，不同类型黄腐酸的元素含量、含氧官能团、化学结构特征及化合物组成存在较大差异，其中 SFA 具有更多的含氮、含氧官能团及化合物组成，分子量较小、芳香性较弱，活性更强，是 MFA 和 BFA 的良好替代产品。
Abstract
The structural differences of mineral source fulvic acid（MFA），biochemical source fulvic acid（BFA），and straw source fulvic acid（SFA）were explored，so as to provide a reasonable basis for the application of fulvic acid in agricultural production.Technologies including elemental analyzer（EA），ultraviolet-visible spectroscopy（UV-Vis）， fourier transform infrared spectroscopy（FTIR），carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy（13C-NMR）， three-dimensional fluorescence spectroscopy（3D-EEMs），and gas chromatography-mass spectrometry（GC/MS）were employed to study the elemental composition，functional group types，chemical structure characteristics and compound composition of different types of fulvic acids. The elemental composition showed that the content of O，S，N and H elements in SFA were higher than that in MFA and BFA，and it had higher the ratios of H/C，O/C，N/C and（N+O）/C．UV-Vis and FTIR showed that compared with MFA，BFA and SFA had weaker aromaticity，more oxygen-containing functional groups on the aromatic ring，smaller molecular weight and lower degree of polymerization. 13C-NMR showed that the carbon structure of the three types of fulvic acids were dominated by alkoxy carbon and aromatic carbon，while the hydrophobicity index and aromatic condensation degree of SFA were lower than those of MFA and BFA. 3D-EEMs showed that the three types of fulvic acids were dominated by oxygen-containing substances with carbonyl，carboxyl，and phenolic structures in terms of composition，among which the carboxyl，carbonyl，and phenolic structures of SFA and BFA accounted for a large proportion，while MFA had more aromatic structures．GC/MS found that MFA，BFA and SFA were composed of 84，93 and 101 compounds，respectively，and the main components were oxygen-containing compounds，accounting for 89.89%， 92.80%，and 86.28%，respectively. The content of nitrogen-containing compounds in SFA was higher than that in MFA and BFA. In summary，there were certain differences in elemental content，oxygen-containing functional groups，chemical structure characteristics，and compound composition of different types of fulvic acid. Among them，SFA had more nitrogen-and oxygen-containing functional groups and compound compositions，smaller molecular weight，weaker aromatics and stronger activity，and it was a good alternative to MFA and BFA.
Keywords
腐植酸（HA）具有增强作物抗逆能力、改善品质、提高化肥利用率和改良土壤等功效[1-2]。黄腐酸（FA）是腐植酸类分子量较小、既能溶于酸又能溶于碱的有机混合物，其水溶性好、活性高，易被植物吸收，具有比其他腐植酸成分更高的生理活性[3]，在农业领域具有广泛的应用潜力[4-5]。黄腐酸可根据其来源和制备工艺分为 3 类：矿物源黄腐酸（MFA）、生物源黄腐酸（BFA）和秸秆源黄腐酸（SFA）。MFA 的原料主要为褐煤、泥炭等不可再生原料，通过工业技术提取，成分单纯、生产过程需要大量酸碱等化工产品，制作成本高[6]；BFA 主要以农作物秸秆、蔗渣、木屑等可再生生物质为原料，通过生物发酵技术制备，其影响因素过多，产品质量不稳定[7]；SFA 以天然植物秸秆为原料，采用人工催化氧化-降解方法制备[8]，更新了黄腐酸加工技术，生产成本低、产品质量稳定。
已有研究表明，黄腐酸主要由 C、H、O、N、 S 等元素组成，其基本结构单元包括芳香族和脂肪族化合物[9]。黄腐酸功能结构包含许多与脂肪族或芳香族基团相连的活性含氧基团，如羧基、酚羟基、醇羟基、羰基、甲氧基等[10]，这些官能团的种类、数量和分布位置对黄腐酸的性质和功能具有重要影响，但目前有关不同类型黄腐酸分子结构及组成等的识别仍处于初步阶段，缺乏系统、深入地研究。因此，本研究以 MFA、BFA 和 SFA 为供试材料，采用元素分析仪 （EA）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振碳谱（13C-NMR） 以及气相色谱-质谱联用技术（GC/MS） 等技术与手段，系统比对分析不同类型黄腐酸的元素组成（C、H、O、N、S）、官能团种类、化学结构及化合物组成等的变化特征，旨在为黄腐酸在农业生产中的应用提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
矿源黄腐酸（MFA）来源于褐煤，通过工业技术提取，深褐色粉末，购自上海易恩化学技术有限公司；生化黄腐酸（BFA）来源于植物源工艺发酵，黄褐色粉末，购自上海通微生物技术有限公司；秸秆源黄腐酸（SFA），来源于小麦秸秆，人工催化氧化-降解方法制备，黄褐色粉末，购自山东泉林嘉有现代农业股份有限公司。
1.2 测定项目及方法
1.2.1 元素组成
使用元素分析仪（Elemental analyzer III，Germany） 测定不同类型黄腐酸样品中 C、H、O、N、S 的含量。黄腐酸的 H/C、O/C、C/N 和（N+O）/C 等原子比可用来鉴别黄腐酸结构的差异性[11-12]，其计算方式如表1所示。
表1元素原子比描述
1.2.2 紫外-可见光谱
采用紫外-可见分光光度计（Hitachi U5700， Japan）对不同类型黄腐酸样品进行紫外-可见光谱检测，扫描范围为 200～800 nm。紫外-可见光谱特征参数如表2所示。
表2紫外-可见光谱特征值描述
1.2.3 傅里叶变换红外光谱
取干燥的黄腐酸样品 1 mg 和溴化钾 200 mg，磨碎混合均匀后压片，采用傅里叶变换红外光谱仪 （Vertex 70，Germany）记录 4000～400 cm-1 范围内的红外光谱，分辨率为 4 cm-1，样品扫描时间 32 s，背景扫描时间 32 s；傅里叶变换红外光谱峰位置及官能团如表3所示。
表3FTIR 峰位置及归属
1.2.4 核磁共振碳谱（13C-NMR）
采用固体核磁 13C-NMR 检测技术（Bruker Avance Ⅲ NMR，Germany）对黄腐酸中有机碳化学结构进行检测。根据化学位移可将黄腐酸的核磁共振碳谱划分为 4个区域[32-35]，即烷基碳区（0～45 ppm）、烷氧基碳区（45～110 ppm）、芳香族碳区 （110～160 ppm）和羰基碳区（160～220 ppm），并通过 MestReNova14 对上述区域进行积分，计算相应有机碳官能团相对含量。
1.2.5 三维荧光光谱
取 10 mg 样品溶于 100 mL 去离子水中，在摇床上 200 r/min 摇 20 min，最后用滤纸过滤。使用荧光光度计（F-7000，Japan），激发波长为 250～600 nm，发射波长为 200～600 nm，激发与发射单元狭缝宽度为 5 nm，激发与发射采集间隔为 5 nm，扫描速度为 2400 nm/min，光电管副高压为 600 V。黄腐酸荧光组分的激发波长（nm）/ 发射波长（nm）及其可能具有的结构参考刘稜等[36]基于三维荧光光谱—平行因子分析在有机质有关结构方面开展的相关研究。
1.2.6 气相色谱-质谱联用
色谱条件：色谱柱为 DB-WAX（30 m×250 μm，0.25 μm）； 起始温度 50℃ 保持 2 min，以 5℃ /min 的速度升至 120℃，以 10℃ /min 的速度升至 230℃保持 10 min；气化室温度 250℃；传输线温度 240℃；载气 He；载气流量 1.0 mL/min；不分流。质谱条件：EI 源；电子能量 70 eV；离子源温度 230℃；四极杆 150℃；扫描模式为 Scan；扫描质量范围为 35～500 m/z。对检测出的成分（匹配因子≥ 80）通过 MSNIST20 进行检索，扣除聚氧硅烷（柱流失成分）等杂质峰，并采用面积归一化法进行定量分析。
1.3 数据处理与分析
使用 Excel 2021 进行数据处理，OMNIC 进行傅里叶红外光谱分析，MestReNova 进行 13C 核磁共振分析，Origin 2022 进行作图。
2 结果与分析
2.1 不同类型黄腐酸元素组成
MFA、BFA 和 SFA 元素含量及元素比见表4。结果显示，MFA 和 BFA 均表现为 C 元素含量最高，其次是 O 元素含量，N 元素含量最低；而 SFA 则是 O 元素含量最高，达 42.35%，其次是 C 元素， H 元素最低。SFA 中 O、S、N、H 元素含量均最高，较 MFA 分别高 8.90%、573.21%、132.87% 和 5.35%，较 BFA 分别高 6.46%、423.61%、75.79% 和 2.61%，而 C 元素含量最低，分别低 33.79% 和 38.77%。此外，SFA 具有较高的 H/C、O/C、N/C 和 （N+O）/C，表明 SFA 可能拥有更多的含氧、含氮官能团和较强的极性，同时 H/C 和 N/C 与稳定性成反比，比值越大，样品越不稳定，活性越高。
表4不同类型黄腐酸元素组成
2.2 紫外-可见吸收光谱分析
紫外-可见吸收光谱可表征黄腐酸中官能团的存在。由图1可知，在 200～800 nm 波长范围内，3 类黄腐酸的吸光度随波长的增加，整体均呈现降低-升高-降低的趋势。与 BFA 和 MFA 相比，SFA 在 200～250 nm 范围内的吸收较强，表明 SFA 中可能含有较多的共轭键或含氧官能团等生色团结构。
紫外-可见光谱特征值可反映黄腐酸的化学结构（ 表5）。与 MFA 和 BFA 相比，SFA 具有较大的 E250/E365，表明 SFA 的芳香性较弱。3 类黄腐酸的E253/E203 大小顺序为 BFA>SFA>MFA，表明 MFA 芳香环上具有较少的含氧官能团取代基。此外，SFA 具有相对较大的 E300/E400 和 E465/E665，表明 SFA 具有较小的分子量、较低的聚合度及芳构化程度。
图1不同类型黄腐酸紫外-可见吸收光谱
表53 类黄腐酸紫外-可见光谱特征参数
注：E250/E365 与芳香性强弱成反比；E253/E203 与芳香环取代程度成正比； E300/E400 与分子量成反比；E465/E665 与样品聚合度及芳构化程度成反比。
2.3 傅里叶红外光谱分析
FTIR 图谱可表征 MFA、BFA 和 SFA 的表面官能团。由图2可知，在 4000～3025 cm-1 的波数范围内可表征—H 和—OH 官能团的伸缩振动，MFA、BFA 仅在 3420 cm-1 处出现峰值，而 SFA 在 3420 和 3221 cm-1 处均出现明显的吸收峰，表明 SFA 存在具有较强的水分系统。SFA、 BFA 和 MFA 在 1690～1600 cm-1 范围内出现的吸收峰是酰胺 I 带产生的，来自蛋白质中肽基团的 C 
O 的拉伸；1600～1500 cm-1 范围内出现的吸收峰是酰胺Ⅱ带产生的，主要来源于 N—H 弯曲，其次是 C—N 的拉伸效应。MFA、BFA 和 SFA 在 1424 cm-1 处出现的吸收峰，是由 1494～1280 cm-1 波数范围内的 —CH、 —NH 拉伸和 —CH 弯曲效应引起的酰胺 III 带的振动产生；在 1115 和 1140 cm-1 处的吸收峰是归因于 1120～950 cm-1 的波数范围内 C—O 键和 C—C 键弯曲振动。在 885～500 cm-1 的波数范围内，是由芳香族和脂肪族 C—OH、C—CH 和 O—CH 键伸缩振动产生的，图谱显示 SFA 在 616 cm-1 波数处的吸收峰较 MFA 和 BFA 明显，表明其含有的官能团含量更高。此外，BFA 和 MFA 在 3000～2800 cm-1 范围内出现 2 个吸收峰，其中 2940 cm-1 处的峰表示甲基中不对称的 C—H 拉伸，2847 cm-1 处的峰表示甲基的对称 C—H 拉伸；在 1262、1215 和 1165 cm-1 处的峰表示羧基 C—O 拉伸以及羧基和苯酚 O—H 变形。BFA 还在 1775 和 1711 cm-1 处出现吸收峰，是羧基 C O 的拉伸振动产生的。总的来看，SFA、BFA 和 MFA 具有相同类型的官能团，但官能团峰值强弱差异明显，表明 SFA 与 BFA 和 MFA 在化学结构上存在较大差异。
O 的拉伸；1600～1500 cm-1 范围内出现的吸收峰是酰胺Ⅱ带产生的，主要来源于 N—H 弯曲，其次是 C—N 的拉伸效应。MFA、BFA 和 SFA 在 1424 cm-1 处出现的吸收峰，是由 1494～1280 cm-1 波数范围内的 —CH、 —NH 拉伸和 —CH 弯曲效应引起的酰胺 III 带的振动产生；在 1115 和 1140 cm-1 处的吸收峰是归因于 1120～950 cm-1 的波数范围内 C—O 键和 C—C 键弯曲振动。在 885～500 cm-1 的波数范围内，是由芳香族和脂肪族 C—OH、C—CH 和 O—CH 键伸缩振动产生的，图谱显示 SFA 在 616 cm-1 波数处的吸收峰较 MFA 和 BFA 明显，表明其含有的官能团含量更高。此外，BFA 和 MFA 在 3000～2800 cm-1 范围内出现 2 个吸收峰，其中 2940 cm-1 处的峰表示甲基中不对称的 C—H 拉伸，2847 cm-1 处的峰表示甲基的对称 C—H 拉伸；在 1262、1215 和 1165 cm-1 处的峰表示羧基 C—O 拉伸以及羧基和苯酚 O—H 变形。BFA 还在 1775 和 1711 cm-1 处出现吸收峰，是羧基 C O 的拉伸振动产生的。总的来看，SFA、BFA 和 MFA 具有相同类型的官能团，但官能团峰值强弱差异明显，表明 SFA 与 BFA 和 MFA 在化学结构上存在较大差异。
图2不同类型黄腐酸傅里叶红外光谱
2.4 不同类型黄腐酸 13C 核磁共振波谱分析
由图3可知，SFA、BFA 和 MFA 的核磁共振碳谱吸收峰具有相似性，但在相同碳化学位移区域吸收峰的强度明显不同（表6）。在烷基碳区（0～45 ppm），MFA 和 BFA 出现信号峰强度弱于 SFA。在烷氧基碳区（45～110 ppm），SFA 出现的信号峰强度高于 MFA 和 BFA，表明 SFA 具有较多的含氧官能团，活性较强。在芳香族碳区（110～160 ppm），SFA 出现的信号峰明显弱于 MFA 和 BFA，表明 SFA 中含有的苯环等芳香结构相对较少。在羰基碳区（160～220 ppm）出现的信号峰表示羧基、醛或酮的羰基碳存在，SFA 的峰强度高于其他两类黄腐酸，但相对占比都不高。此外，MFA 和 BFA 的疏水性指数和芳香度相差不大，而 SFA 的疏水性指数和芳香度明显较低，表明 SFA 较 MFA 和 BFA 的亲水性更好和芳香结构更少。总的来看，SFA、BFA 和 MFA 的碳结构以烷氧基碳和芳香碳占比为主，其中 MFA 和 BFA 的芳香碳峰较为明显，表明 MFA 和 BFA 的芳香缩合程度较高，且较稳定，而 SFA 的芳香缩合程度较低，较不稳定。
图3不同类型黄腐酸的 13C 核磁共振波谱
表6黄腐酸主要碳结构化学位移区域及占比
注：疏水性指数 =（烷基碳区 + 芳香族碳区）/（烷氧基碳区 + 羰基碳区）；芳香度 = 芳香族碳区 /（烷基碳区 + 烷氧基碳区 + 芳香族碳区）。
2.5 三维荧光（3D-EEM）分析
由图4可知，MFA、BFA 和 SFA 的荧光强度有所不同，但它们的荧光峰值均集中在相似的区域，表明 3 类黄腐酸可能含有相似的荧光团或化学成分，但由于它们的分子结构和物质浓度的差异，导致荧光强度不同。
为了更清晰地解析不同类型黄腐酸的组成成分，利用三维荧光光谱与平行因子分析相结合的手段，通过 PARAFAC 模型分别识别出了 MFA、BFA 和 SFA 中 3 种组分的荧光发射矩阵（EEM）图谱 （图5），并将各组分的最大激发波长和发射波长及相应结构特征列于表7，结果表明，MFA、BFA 和 SFA 在组成物质上均以羰基、羧基和酚类结构的含氧类物质为主，其中 SFA 和 BFA 中的羧基、羰基及酚类结构占比较大，而 MFA 相对稳定的芳香性和疏水性结构占比则较多。
图4不同类型黄腐酸的三维荧光光谱
图5不同种类型黄腐酸的荧光组分及载荷
表73 种类型黄腐酸荧光组分激发波长（nm）/ 发射波长（nm）占比和结构特征
2.6 气相色谱-质谱联用（GC/MS）分析
图6为 MFA、BFA 和 SFA 的气相色谱-质谱联用（GC/MS）分析所获得的总离子流图（TIC）。从图6中可以看出，在 MFA、BFA 和 SFA 中均检测到多种化合物，但各自的峰强度和保留时间有所不同，可反映出不同类型黄腐酸在结构上的多样性和复杂性。
图63 种类型黄腐酸的总离子流图
分别从 MFA、BFA 和 SFA 的总离子流图中分离鉴定出 83、94 和 101 种化合物。不同类型黄腐酸在化合物种类和含量上差异较大，但均以含氧类化合物为主，其中 MFA 中含氧化合物为 59 种，占比 89.89%；BFA 中含氧化合物为 63 种，占比 92.80%；SFA 中含氧化合物为 64 种，占比 86.28%。综合 GC/MS 结果，SFA 中含氧化合物占比略低，但其含氧化合物中的含氧官能团相对较多，表明 SFA 相较于其他两类黄腐酸活性更强。
MFA、BFA 和 SFA 的前 10 种化合物分别占各自总化合物的 83.16%、89.41% 和 90.66%（表8），可反映 MFA、BFA 和 SFA 的主要化合物组成。 MFA 中含有的苯环结构相对较多，如苯酚和 2，4-二甲基苯甲醛等，主要为芳香结构；BFA 中含有的芳香结构主要是杂环化合物，如 3-糠醛和糠醇等，芳香性较苯环结构相对较弱；SFA 中的芳香结构相对较少，主要是含氮杂环化合物，如 1H-四氮唑。总的来看，MFA、BFA 和 SFA 的主要成分是含氧化合物，其中 MFA 和 BFA 以芳香结构为主的化合物相对较多，说明 MFA 和 BFA 的芳香性较强。
表8不同类型黄腐酸中前 10 种化合物的占比
续表
3 讨论
黄腐酸是广泛存在于自然界中的有机物质，是腐植酸的重要组成部分。已有研究表明，黄腐酸主要以 C、H、O、N、S 等元素组成，且 C 和 O 元素占比较大[36-39]，本文的研究结果也验证了这一点。本研究还发现，SFA 中 O、S、N、H 元素含量均高于 MFA 和 BFA，这差异性结论可能与黄腐酸的来源、生产方式等密切相关[40-42]。从官能团种类和数量来看，Wu 等[43]研究发现，木本泥炭黄腐酸具有较多的C O 和 C—O，而苔藓黄腐酸则是羧基较多；马力通等[44] 研究表明，利用不同碱液提取的褐煤黄腐酸所含官能团种类相同，但数量不同。此外，梁媛媛等[45] 研究表明，不同分子量黄腐酸的官能团也存在明显差异。本研究结果显示，SFA、BFA 和 MFA 在官能团种类上无明显差异，但其官能团含量差异明显，表明其生物活性各异，其中 SFA 具有更多的含氮、含氧官能团，分子量较小，芳香缩合程度较低，更易被植物吸收，差异性结论主要归功于黄腐酸的来源、分子量大小及提取方法等。
O 和 C—O，而苔藓黄腐酸则是羧基较多；马力通等[44] 研究表明，利用不同碱液提取的褐煤黄腐酸所含官能团种类相同，但数量不同。此外，梁媛媛等[45] 研究表明，不同分子量黄腐酸的官能团也存在明显差异。本研究结果显示，SFA、BFA 和 MFA 在官能团种类上无明显差异，但其官能团含量差异明显，表明其生物活性各异，其中 SFA 具有更多的含氮、含氧官能团，分子量较小，芳香缩合程度较低，更易被植物吸收，差异性结论主要归功于黄腐酸的来源、分子量大小及提取方法等。
从结构组成来看，Chi 等[46]通过三维荧光技术表明黄腐酸具有较多羧基和羰基；Mu 等[47]也通过三维荧光等技术发现黄腐酸较腐植酸共轭结构少，芳构化程度低，且富含羧基和羟基；Qin 等[48]通过气相色谱-质谱联用技术发现，黄腐酸中具有酸、醇和酯基团的含氧化合物占比最大；王智[49] 进一步通过热裂解-气相色谱-质谱分析发现黄腐酸中含氧化合物占比最大，并且大多数黄腐酸的裂解产物中含羧基的化合物占比较大。本研究通过三维荧光光谱和 GC/MS 分析发现，3 类黄腐酸的分子结构相似，但 SFA 的羧基、羰基和酚类等结构占比较大，化合物种类较多，不仅拥有大量含氧化合物，还有少量含氮化合物，能够为作物养分吸收提供更加丰富的营养元素，在农业生产中具有较好的应用效果。总之，黄腐酸是一类结构复杂、组成多样的混合物，深入解析黄腐酸的分子结构和化合物组成等，可为其在农业生产中的科学施用提供重要的理论基础。
4 结论
不同类型黄腐酸的元素含量、含氧官能团含量、化学结构特征及化合物组成存在较大差异。 SFA 中的 O、S、N、H 元素含量高于 MFA 和 BFA，且具有较高的 H/C、O/C、N/C 和（N+O）/C。3 类黄腐酸均呈现出复杂的分子结构，主要由多样化的脂肪族和芳香环结构以及较多的含氧官能团构成，其中 MFA 中的苯环等芳香性较强的结构较多， BFA 和 SFA 中芳香性较弱的杂环结构较多；且 MFA 中羧基、羰基和酚类结构的总含量明显低于 BFA 和 SFA。此外，SFA 具有更多的含氮、含氧官能团及化合物组成，分子量较小、芳香性较弱，亲水性强，活性高，是 MFA 和 BFA 的良好替代产品。