摘要
为探明 3 种微生物肥料对穿心莲根际土壤微生态结构的影响，以穿心莲为试验材料，设置高浓度光合细菌液肥（GH）、寡糖液肥（GT）、小球藻液肥（XQ）和清水（CK）的 4 个处理，采用高通量测序技术分析穿心莲根际微生物对 3 种肥料处理的生态响应及其引起的群落结构变化情况。结果显示：各施肥处理组中全氮含量均出现显著提升（P<0.05），其中施用小球藻肥后全氮含量提升了 52.17%，作用效果 XQ>GH>GT。碱解氮含量也出现微量提升，作用效果 GT>XQ>GH。施用光合细菌肥料和寡糖肥料均提高了土壤中速效钾含量，且前者达到显著水平（P<0.05）。施用菌肥后土壤中有效磷含量均出现一定程度下降，表现为 XQ>GT>GH，但均未达到显著水平。冗余分析结果显示：穿心莲根际土壤养分因子中，速效养分（速效钾、有效磷）在较大程度上解释了土壤微生物群落结构的变化情况。穿心莲 4 个处理组根际土样中检测出主要优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）等，主要优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门 （Basidiomycota）。主坐标分析表明根际微生物群落结构因微生物肥料的使用产生了显著性变化（P<0.05）。研究表明，施用微生物肥料能显著影响根际菌群结构，在一定程度上降低了土壤中真菌与细菌 OTU 数量的比值，增加土壤肥力并促进植物对必需营养元素的吸收。研究结果为穿心莲种植遴选适宜微生物肥料种类以及益生菌群构建提供了理论参考。
Abstract
To explore the effects of three kinds of biofertilizers on the microenvironmental structure of the rhizosphere soil of Andrographis paniculata，an experiment was conducted with the Andrographis paniculata rhizosphere soil treating with high concentration photosynthesizing bacterial liquid fertilizer（GH），oligosaccharides liquid fertilizer（GT），Chlorella liquid fertilizer（XQ），and clear water（CK），respectively. The Illumina high-throughput sequencing technology was used to analyze the ecological responses of the microorganisms and the community structure of Andrographis paniculata’s rhizosphere soil to the three different kinds of fertilizer treatments. The results showed that the total nitrogen content in each fertilization group were significantly increased（P<0.05）with the effect of XQ>GH>GT，especially the total nitrogen content was increased by 52.17% after the application of Chlorella fertilizer. The alkaline hydrolysis nitrogen content also showed a slight increase，with the effect of GT>XQ>GH. The application of photosynthetic bacteria fertilizer and oligosaccharide fertilizer both increased the content of available potassium in the soil，and the former reached a significant level（P<0.05）. After the application of microbial fertilizer，the content of available phosphorus in the soil decreased to a certain extent，showing XQ>GT>GH，but did not reach a significant level. The results of redundancy analysis showed that among the inter-root soil nutrient factors of Andrographis paniculata，the available potassium and available phosphorus explained to a greater extent the variations in soil microbial community. The main dominant bacterial phyla detected in the rhizosphere soil samples of Andrographis paniculata in the treatments were Proteobacteria，Acidobacteriota and Bacteroidota，etc. The main dominant fungal phyla were Ascomycota and Basidiomycota. The principal coordinate analysis showed that the structure of rhizosphere soil microbial community was significantly changed（P<0.05）due to the application of biofertilizer. The study showed that the application of biofertilizer could significantly affect the structure of the rhizosphere microbiota，reduce the ratio of fungal and bacterial OUT counts in the soil，increase soil fertility and promote the uptake of essential nutrients by plants. This study could provide a theoretical reference for the selection of suitable bacterial fertilizer and the construction of probiotic communities in Andrographis paniculata cultivation.
穿心莲（Andrographis paniculata）属于爵床科植物，食味极苦，具有清热解毒、抗菌消炎的功效，是一种广泛使用的传统中药植物，在中国华南地区大面积种植。穿心莲主要药用成分为穿心莲内酯及其衍生物，对流感、急性细菌性痢疾和胃肠炎等多种感染性疾病以及神经性皮炎、湿疹等[1]有较好的治疗效果。
肥料在提升经济作物的产量和改善其品质方面扮演着至关重要的角色，是农业生产中不可或缺的关键投入之一[2-3]。作为一种喜肥的植物，穿心莲的生长和药用成分的积累与施肥密切相关。但长期过量地施用化肥，不仅会影响穿心莲对养分的吸收和利用，还可能导致氮素的流失，进而降低土壤的生物活性，连带使穿心莲有效成分含量下降，从而限制穿心莲作为药材的持续发展[4]。因此，合理施肥对于保证穿心莲品质和可持续发展至关重要。
土壤微生物作为土壤环境中能量流动和物质循环的枢纽，其丰度和活性构成土壤生物肥力的根本[5]。植物、根际土壤和菌群三者的相互作用使植物根际区域形成了一个独特的土壤微生态系统[6]。微生物肥料是一种新型绿色肥料，往往含有丰富的有益活性物质、菌体或藻体，能够与土壤中的土著菌群相互影响，形成新的微生物群落结构。研究表明，施加微生物肥料能同步调节土壤微生物组的结构和多样性，抑制病原菌生长，是提高作物抗性和土壤肥力的关键[7]。沙月霞等[8]研究发现生物菌剂的施用能使土壤中变形菌门、放线菌门等优势细菌菌门丰富度增加，亚硝化球菌和氨氧化古菌等参与氮循环的菌体丰度也增加了 20% 以上。曹佩[9] 发现土壤中固氮以及与病原防控有关的微生物相对丰度因菌肥的施用而显著增加，病原微生物丰度则与之相反。卢红[10]证实适宜浓度的微生物菌肥在不施肥处理的基础上，能显著提高穿心莲生长相关的农艺指标，其效果优于化肥处理。边建文等[11]综述了微藻作为生物肥料具有固氮、固碳、分泌多种生物活性物质、富含微量元素等优异特性，可以影响土壤理化性质，改善土壤质量，促进种子萌发、幼苗生长，影响果实品质以及作物产量，因此微藻生物肥料在农业生产和农业生态保护方面具有极为重要的应用价值。可见，合理有效地施用生物肥料对植物的生态化栽培种植具有重要的意义。
尽管众多研究已经证实，微生物肥料的施用能提升中药材品质、有效成分含量以及产量，但关于施用微生物肥料对中药材穿心莲的根际土壤菌群群落结构的影响鲜有报道。基于此，本研究施用光合细菌肥料、寡糖肥料和小球藻肥料，研究其对穿心莲根际微生物群落结构的影响，深入探讨穿心莲根际微生物对不同种类微生物肥料的生态响应，旨在为穿心莲栽培生产过程中肥料的合理选用提供参考，并为人为调控和构建益生菌群、实现高质量药材的产业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试土壤：本试验以湛江市遂溪县良好农业规范基地规模化连片种植的穿心莲根际土作为研究材料，种植试验区位于广东省湛江市雷州半岛北部的遂溪县岭北镇（21°38′N，110°25′E），为亚热带海洋季风气候。
供试肥料：①光合细菌菌剂：含沼泽红假单胞菌≥ 2×108 cfu·mL-1；②寡糖菌液：含植物乳杆菌≥ 3×106 cfu·mL-1，嗜酸乳杆菌≥ 2×106 cfu·mL-1，褐藻酸寡糖≥ 1 mg·L-1；③小球藻液肥：含蛋白核原始小球藻≥ 5×106 个·mL-1。以上生物肥料均由广东绿百多生物开发有限公司提供。
1.2 试验设计
田间试验共设置 4 个处理组：①施用光合细菌菌剂 100 倍液肥（标记为 GH），5 m2 浇灌施 50 L； ②施用寡糖菌液 500 倍液肥（标记为 GT），5 m2 浇灌施 50 L；③施加小球藻 100 倍液肥（标记为 XQ），5 m2 浇灌施 50 L；④对照组浇灌清水（标记为 CK），5 m2 浇灌 50 L。每种处理重复 3 次，共计 12 个随机排列的试验小区，每小区面积为 10 m2。施肥前先用水把土壤浇灌湿透，再将相应稀释浓度的菌肥浇灌到作物根部，其他田间管理、追肥与常规相同。
1.3 根际土壤样品采集
2022 年 9 月，采用五点取样法在种植基地的不同试验地块各随机采集 12 株完整穿心莲植株，注意避免根系的机械损伤。10 h 内将收集到新鲜植株样本装入放有冰袋保鲜的保温箱中运送到实验室，4 株为一平行组，清扫其根系 2 mm 范围的土壤，所得即为根际土，过 2 mm 孔径网筛。4 组处理各 3 个平行重复，样品标记为 CK-1、CK-2、 CK-3、GH-1、GH-2、GH-3、GT-1、GT-2、 GT-3、XQ-1、XQ-2、XQ-3。每组土壤样本分为两部分，一部分放置于-80℃冰柜内冷藏，用于高通量测序，以测定根际微生物群落组成及结构。另一部分置于阴凉处风干，研磨后过 0.425 mm 孔径网筛，用于土壤理化性质测定。
1.4 指标测定及方法
1.4.1 土壤理化性质测定
参考鲍士旦[12]的测定方法。土壤有机质含量的测定采用重铬酸钾氧化还原滴定法，碱解氮和全氮含量的测定分别采用碱解扩散法和凯氏定氮法。有效磷和全磷含量的测定采用钼锑抗比色法，速效钾和全钾含量的测定采用火焰光度法。
1.4.2 根际土壤总 DNA 提取、建库与测序
选用广州美基生物科技有限公司的土壤 DNA 提取试剂盒（HiPure Soil DNA Kits），按照说明书提取根际土壤微生物总 DNA，利用 NanoDrop 微量分光光度计检测核酸的 OD 值，测定其纯度，最后用琼脂糖凝胶电泳法检验总 DNA 样本的完整性。使用 AMPure XP Beads 对两轮扩增的 PCR 产物进行纯化，寄送至广州基迪奥生物科技有限公司，将纯化并定量后的扩增子连接测序接头，构建测序文库，经 Illumina 上机测序。
1.5 数据分析与处理
测序得到 Raw Reads 之后，利用 FASTP 分别对双端的 Raw Reads 数据进行质量过滤，去除低质量数据或无生物学意义数据（如嵌合体），得到质控后的 PE Reads。根据 PE Reads 之间的 overlap 关系，利用 Flash 对每对 PE Reads 进行拼接，得到原始的拼接序列。再对 Tags 进行质量过滤，最终得到高质量 Clean Tags。
用 Usearch 的 Usearch 算法，基于所有样品的全部 Clean Tags 以 97% 的一致性聚类成为 OTU，聚类的同时用 Usearch 的 Uchime 算法去除 Tags 嵌合体，得到去除嵌合体以后的高质量 Tags 数，即 Effective Tags。获得 OTU 后，基于 Effective Tag 进行 OTU 丰度统计。聚类后的 OTU 用于稀释曲线的构建、 α-多样性分析（包括 Chao1 指数、Shannon 指数、 Simpson 指数）、β-多样性分析、物种组成及差异分析等。采用基于 Bray-curtis 距离矩阵的主坐标分析（PCoA）方法分析施加不同菌肥的土壤微生物群落 β-多样性差异，基于 Anosim 和 Adonis 算法对多样性数据进行差异性检验。韦恩图用于统计多组或多个样本中所共有和独有的 OTU 数目。利用冗余分析（RDA）及 Pearson 相关性分析解析微生物群落组成与土壤养分因子的关系。
以均值 ± 标准误差（n=3）表达处理组的数据结果，差异显著性检验采用单因素方差分析的方法，显著性水平设置为 0.05，并设置好最小显著性差异法进行多重比较分析，经 SPSS 27.0 运行，上述数据使用 Excel 2018 完成整理和统计。
2 结果与分析
2.1 施用微生物肥料后穿心莲根际土壤微生物群落结构组成差异分析
2.1.1 施用微生物肥料后穿心莲根际土壤细菌群落差异分析
4 组穿心莲试验处理中，共检测到细菌 43 门 130 纲 297 目 393 科 706 属。从门的层面来看（图1A），根际土壤中相对丰度 >1% 的细菌门共计 14 个，其中有 13 个菌门在不同处理穿心莲根际土壤中相对丰度均大于 1%，而 Armatimonadota 门仅在 GH 组中的相对丰度超过 1%。变形菌门（Proteobacteria19.96%～28.92%）在4个处理中占有绝对优势，其次是酸杆菌门（Acidobacteriota11.37%～13.04%） 和拟杆菌门（Bacteroidota10.38%～11.86%）。
门水平上（图1A），与对照组（CK）相比，施加 3种微生物肥料能不同程度降低髌骨细菌门（Patescibacteria）丰度、提升蓝藻细菌门（Cyanobacteria）的丰度。对髌骨细菌门细菌生长的抑制效果排序为 XQ>GT>GH，降幅分别为 39.12%、 34.19%、13.57%，对蓝藻细菌门细菌生长的促进效果排序为 GT>GH>XQ，提升比例分别是 76.72%、7 2.64%、34.78%。此外，施用寡糖肥料能明显提升穿心莲根际土壤中变形菌门的丰富度，增幅达 34.09%，而施用小球藻肥的穿心莲根际土壤中变形菌门和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度也分别提升了 44.89% 和 36.34%。这表明施用微生物肥料对土壤门水平上的细菌群落结构产生了一定的影响。
图1门（A）、属（B）水平上穿心莲根际土壤细菌的相对丰度
在属水平上（图1B），4 组穿心莲根际土壤样品的主要细菌属（占比超过 1%）共计 17 个，其中 7 个属为所有处理组共有。相较于 CK 组，3 种肥料的施用都能升高 RB41 属（1.91%～2.68%）、发光杆菌属（Photobacterium 0.02%～3.62%）、假单胞菌属（Pseudomonas 0.97%～3.18%）、链霉菌属 （Streptomyces 0.61%～1.12%）、不动杆菌属（Acinetobacter 0.06%～1.77%）、弧菌属（Vibrio 0.13%～2.53%）和肠杆菌属（Enterobacter 0.29%～1.57%）等的丰度，降低 Candidatus_Udaeobacte 属（2.19%～1.62%）、硝化螺旋菌属（Nitrospira1.81%～1.25%）、杆菌属（Bryobacter 1.94%～1.44%）和黄杆菌属（Flavobacterium）（1.12%～0.65%）等的丰度，抑制和促进程度各不相同。3 种肥料对弧菌属和不动杆菌属丰度的提升效果表现为 GT>XQ>GH，对肠杆菌属丰度的提升效果为 XQ>GT>GH，对发光杆菌属丰度的提升效果为 XQ>GH>GT。施用寡糖肥料对 RB41 属丰度提升最大，达 40.35%，其对黄杆菌属的抑制效果也最大，为 42.05%。小球藻肥料对假单胞菌属细菌丰度的提升效果高达 228.55%。施用光合细菌肥料对 Candidatus_Solibacter 属和链霉菌属丰度占比提升最大，分别为 44.0% 和 82.98%。GT 组和 XQ 组根瘤菌属细菌丰度分别提升了 38.03% 和 28.63%，在 GH 组其占比降低了 21.59%。结果说明微生物肥料的施用可以增加部分根际土壤细菌的丰度，但作用效果存在差异。
2.1.2 施用微生物肥料后穿心莲根际土壤真菌群落组成差异分析
4 组穿心莲试验处理中，共鉴定出 18 门 38 纲 84 目 169 科 292 属的真菌。图2展示了各处理组在真菌门和属水平上的群落结构及相对丰度。门水平上（图2A），4 个处理组中存在的相对丰度大于 1% 的真菌门共计 4 个，其中子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为各处理组共有的优势真菌门。被孢霉门（Mortierellomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）只分别在 XQ 组和 CK 组中丰度 >1%。与 CK 组相比，施肥组均促进了子囊菌门真菌的生长，光合细菌和寡糖肥料不同程度地提升了担子菌门的丰度，分别为 17.7% 和 27.0%，小球藻肥料却降低了担子菌门的丰度，降幅达到 36.60%。3 种肥料均表现出对壶菌门真菌生长的抑制作用，效果表现为 GT>GH>XQ。光合细菌肥料的施用降低了被孢霉门的丰度，小球藻肥料施用效果则相反，提升了 49.03% 的丰度占比。由以上结果可知 3 种肥料的施用对穿心莲根际土壤中优势菌门的影响效果有明显差异。
在属水平上（图2B），CK 组和处理组的主要真菌共计 6 属，其中棒孢菌属（Corynespora）、小不整球壳属（Plectosphaerella）、镰孢菌属（Fusarium）和小脆柄菇属（Psathyrella）为各处理组中共有的主要菌属。施肥处理升高了棒孢菌属 （Corynespora）的丰度，其中寡糖和光合细菌肥料作用效果最明显，分别提升了 127.27% 和 66.89%。 3 种肥料作用均降低了镰刀菌属的丰度占比，作用效果 XQ>GH>GT。小球藻肥料的施用能升高被孢霉属（Mortierella）的丰度并能显著升高小不整球壳属和半支亚门炭疽菌属（Colletotrichum）的丰度，而光合细菌肥料则能降低以上菌属的丰度。小脆柄菇属的丰度在 GH 组和 GT 组都分别上升了 35.35% 和 61.40%，在 XQ 组下降了 23.92%。这说明施用微生物肥料在真菌属水平上引起了一定的群落结构变化。
图2门（A）、属（B）水平上穿心莲根际土壤真菌的相对丰度
2.2 施用微生物肥料后穿心莲根际土壤微生物多样性分析
12 个根际土壤样品经高通量测序共得到了 1476696 条拼接后的细菌原始序列，经过滤后得到 1462025 条优化序列，用于物种注释的有效序列总数为 1108148 条，聚类后共得到 52928 个 OTU；真菌双端 Reads 经拼接后产生 1449138 条原始序列，过滤后得到 1439984 条有效序列，最终可用于物种注释的高质量有效序列为 1428128 条，聚类后得到 13674 个 OTU。根据对稀释曲线的分析，随着测序条数的增加，所有样品中的真菌和细菌的稀释曲线都趋向于平缓，可知样品已测序充分。
2.2.1 施菌肥后土壤微生物 β-多样性差异分析
采用 PCoA 图展示样品间微生物群落差异大小。结果（ 图3A） 显示，PCoA 的2个主成分轴共解释了 73.29% 的群落差异，其中 PCo1 和 PCo2 贡献率分别为 58.80% 和 13.49%。施用寡糖肥料和光合细菌肥料的 3 个土样点离散程度小，施用小球藻肥料 3 个土样之间的分隔较大。总体来看，各处理组细菌群落在门水平上有明显区分。基于 Anosim 和 Adonis 算法进行的差异性检验分析（表1）进一步表明 CK 组与施肥组之间门水平上的细菌群落存在显著差异 （P<0.05）。
图3B 描绘了真菌的 PCoA 分析结果，2 个主成分轴共解释 65.72% 的群落差异，PCo1 和 PCo2 分别解释了 42.26% 和 23.46%。结果表明 3 种肥料处理的各土样之间的空间位点比较分散，而根据表2中 Anosim 差异检验分析结果可知，CK 组和施肥处理组间的真菌群落在属水平上也呈现出明显差异 （P<0.05）。表明施用微生物肥料显著影响了细菌和真菌群落结构。
图3基于 Bray-curtis 距离矩阵的主坐标分析
表1不同微生物肥料处理穿心莲根际土壤细菌群落差异性分析
注：* 表示不同处理土壤细菌群落组成有显著性差异（P<0.05）。
表2不同微生物肥料处理穿心莲根际真菌群落差异性分析
注：* 表示不同处理土壤真菌群落组成有显著性差异（P<0.05）。
2.2.2 施用微生物肥料后穿心莲土壤微生物群落的相关性差异分析
根据图4A 可知，所有土壤样品中细菌的 OTU 数量普遍高于真菌的 OTU 数量。在各施肥处理组，穿心莲根际土样共有的细菌 OTU 数量为 1529 个，分别占各自处理组总 OTU 数的 27.30%、26.45%、 28.08%、28.05%。而 CK、GH、GT、XQ 这 4 个特定处理组中特有的细菌 OTU 数量分别为 3297、 3351、3112、3141 个，分别占各自处理组总 OTU 数的 58.88%、57.98%、57.14%、57.62%。GH 处理组中细菌 OTU 的数量略高于 CK 组，而 GT 和 XQ 处理组中细菌 OTU 的数量与 CK 组相比分别下降了 2.75% 和 2.67%，总体上，3 组施肥处理组土壤中细菌组成与 CK 组较为接近，施肥并未对穿心莲根际土壤细菌群落组成带来显著影响 （表3）。
真菌 OTU 韦恩图如图4B 所示，各处理组共有的真菌 OTU 数量为 614 个，分别占到了各自总 OTU 数的 43.06%、50.54%、48.31%、51.81%。而 CK、GH、GT、XQ 4个处理组中特有 OTU 数分别为 340、211、201、199 个，独有的真菌 OTU 分别占到了各自总 OTU 数的 23.84%、17.37%、 15.81%、16.79%。施肥处理后，各处理组的真菌 OTU 总数相较于 CK 组均有所下降，其中以 XQ 组的降幅最为显著，下降了约 16.90%； 其次是 GH 组，下降了约 14.79%；GT 组的降幅最小，约为 10.87%（ 表3）。这一结果表明，施用微生物肥料可能会降低根际土壤中真菌群落数。
由图4可知，经不同施肥处理的穿心莲根际土壤样品中共有细菌 OTU 数量有 1529 个，而 CK 组土壤中特有的细菌 OTU 数量达到 3297 个，分别占对照组细菌 OTU 总数的 27.30% 和 58.88%。相比之下，各处理组共有的真菌 OTU 数量为 614 个， CK 组土壤中特有的真菌 OTU 数量为 340 个，这些比例分别占 CK 组真菌 OTU 总数的 43.06% 和 23.84%。CK 组土壤中细菌 OTU 的共有比例小于真菌，而特有比例大于真菌，这表明，在施肥后，根际土壤中的细菌 OTU 类型的干扰和变化程度要比真菌更大。
图4不同施肥处理的根际土壤微生物 OTU 韦恩图
表3穿心莲土壤样本测序获得的细菌和真菌 OTU 序列数
2.3 施用微生物肥料对穿心莲根际土壤养分的影响
针对不同施肥处理的穿心莲根际土壤，开展全氮、全磷、全钾、有机碳、碱解氮、有效磷和速效钾等指标的测定。由表4可知，与 CK 组相比，施加肥料后土壤中全氮含量均出现显著提升（P<0.05），其中施用小球藻肥后全氮含量提升最大，提高了 52.17%，作用效果 XQ>GH>GT。土壤中碱解氮的含量也出现微量提升，作用效果GT>XQ>GH。施用光合细菌肥料显著提高了土壤中的速效钾含量（P<0.05），达 15.84%，土壤中有机质以及全磷的含量也略高于 CK 组，但未达到显著水平。施加寡糖肥料使得土壤中全钾含量略低于 CK 组，速效钾含量略高于 CK 组。施小球藻肥料小幅降低了根际土壤中全磷和速效钾的含量。另外，施用菌肥后土壤中有效磷的含量均出现一定程度下降，且下降程度 XQ>GT>GH，但作用效果并不显著。可见，施加微生物肥料不同程度地促进植物对营养元素的吸收，并且可能在一定程度上促进了固氮菌的生长，进而提升了土壤中全氮和碱解氮的含量。
表4不同微生物肥料处理后穿心莲根际土壤养分含量变化
注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
2.4 穿心莲根际土壤微生物群落组成与土壤养分含量的相关性分析
对门分类水平上的根际土壤总微生物中相对丰度 >1% 的优势类群进行 RDA，探究特定细菌和真菌与土壤养分因子的相关性（图5）。穿心莲根际细菌群落关联性分析（图5A）显示被选择的土壤养分因子共解释了土壤细菌群落变化的 86.74%，分别解释了细菌总变异的 77.82%（RDA1） 和 8.92%（RDA2）。土壤中碱解氮的含量显著影响细菌群落结构，P 值为 0.009；在土壤真菌中 （图5B），被选择的土壤养分因子共解释了真菌群落变化的 99.01%，分别解释了真菌总变异的 87.32%（RDA1）和 11.69%（RDA2）。速效钾含量显著影响真菌的群落结构，P 值为 0.022。真菌土壤样本分布较细菌土壤样本更离散。
基于 Pearson 分析优势菌门与土壤养分之间的关系（图6），由细菌门与土壤理化性质相关性分析热图（图6A）可知，拟杆菌门丰度与土壤中碱解氮和速效钾含量均呈显著负相关（P<0.05），芽单胞菌门（Gemmatimonadota）丰度与碱解氮呈显著正相关（P<0.05），放线菌门（Actinobacteriota） 与速效钾呈显著正相关（P<0.05），与有效磷呈极显著正相关（P<0.01）。由图6B 可知，真菌门类中的担子菌门丰度与速效钾含量呈极显著正相关 （P<0.01），罗兹菌门（Rozellomycota）的丰度与全氮含量呈显著负相关（P<0.05）。
图5土壤养分与细菌（A）和真菌（B）群落的冗余分析
注：AN 表示碱解氮，SOM 表示有机质，TN 表示全氮，TP 表示全磷，TK 表示全钾，AK 表示速效钾，AP 表示有效磷。下同。
图6细菌（A）和真菌（B）门水平与土壤养分相关性分析热图
注：* 表示显著相关（P<0.05），** 表示极显著相关（P<0.01）。
3 讨论
3.1 微生物肥料施用对穿心莲根际土壤微生物的影响
土壤微生物的数量和活性是评估土壤质量的关键指标之一，同时土壤中微生物的种类及其数量又是判断土壤肥力水平的重要依据[13]。经 β-多样性差异分析表明，施用微生物肥料明显改变了微生物群落结构（P<0.05），这与刘丽[14]对北柴胡土壤微生态的研究结果相同。OTU 聚类分析结果表明，施肥后根际土壤细菌 OTU 类型变化比真菌更大。土壤中的真菌型和细菌型是衡量土壤肥力变化的重要生物指标[15]。本研究结果表明，使用微生物肥料后的土壤中真菌和细菌的丰度指数总体呈现下降趋势，真菌和细菌的 OTU 数量比例与对照组均出现不同程度的下降。此结果与韦建玉等[16]和高吉坤等[17]研究菌剂对黄瓜、植烟土壤微生物量影响的结论一致。通常情况下，土壤中真菌的数量及其与细菌的比例越低，土壤生态系统越稳定性，抑制病害的能力也越强[18]，本研究中 3 种肥料的施用在一定程度上降低了穿心莲植株病害发生的可能性。
3.1.1 对根际土壤细菌群落的影响
从细菌门水平上看，主要优势菌门有变形菌门（19.96%）、酸杆菌门（13.04%）和拟杆菌门（11.27%），变形菌门占主导地位。该结果与杨楠等[19]开展的施加微生物菌剂对马铃薯根际菌落影响的结果以及曹佩[9]基于生物肥料对西洋参根际微生物结构重建而得出的研究结果一致。各施肥处理组均会提升变形菌门、蓝藻细菌门、厚壁菌门的相对丰度，并且降低髌骨细菌门的比例。这与赵蕾[20]研究得出添加菌剂组的变形菌门和蓝藻细菌门的相对丰度明显高于对照组的结论相似。变形菌门细菌能够通过分解有机物质释放氮气，以此增加土壤中的可利用氮含量[21]，作为本研究根际土壤中最具优势的细菌门，其丰富度很可能与土壤营养程度有关。小球藻肥料处理后土壤中变形菌门的丰度相较于其他施肥处理出现最大增幅，侧面说明了该处理下土壤样品中养分供应更为充足。有研究表明，蓝细菌作为一种光合自养型微生物，可以利用光能固定碳和氮，还能够进行光合作用并释放氧气，这对土壤生物是一种重要的生态服务[22-23]。已有研究证实光合细菌制成的生物肥料能够助力植物的光合作用[24]，光合细菌包含了多个菌门，施用光合细菌和寡糖肥料可以使蓝藻细菌门丰度占比提高 72.64%～76.72%，可能是因为菌剂中含有源自蓝藻细菌门的光合细菌从而提升了蓝细菌丰度或是两种菌肥施用后根际土壤环境及结构的改变促进蓝细菌增殖进而出现了菌群富集。髌骨细菌门在施菌肥后丰度的下降，推断是由于该门细菌群落稳定性易受土壤环境因素影响，短期菌肥的施用可能改变了原本适宜其生长的土壤条件，具体变化原因以及其在根际土壤中的功能有待进一步探究。
从根际细菌属水平上看，施用不同微生物肥料均提升了假单胞菌属、发光杆菌属、肠杆菌属、链霉菌属等有益菌属的丰度，不同程度降低了硝化螺旋菌属、黄杆菌属的丰度占比。其中施用小球藻肥料对假单胞菌属、发光杆菌属、肠杆菌属以及根瘤菌属的丰度提高最大，施用光合细菌肥料对链霉菌属丰度提升最大，而寡糖肥料的施用则对 RB41 属、弧菌属和不动杆菌属有最大的提升作用。假单孢菌属能抑制植物病原微生物的生长以及降解有毒物质[25]，部分发光杆菌属的细菌显示出对植物病原体的抑制作用[26]，根瘤菌的接种可以显著提高土壤中养分及有机质含量，肠杆菌属细菌能参与土壤有机质的分解过程并展现出色的解磷能力[27-28]。在根际土壤中，硝化螺旋菌属有亚硝化及硝化作用[29]，黄杆菌属具有植物促生作用[30]，施用 3 种肥料却降低了两者丰度，尤以寡糖肥料对两者丰度降幅最大，这种抑制情况与樊祖清等[31]得出菌肥能增加有益菌含量的结论相悖，推断认为其在土壤中的存活受多种土壤微生物的干预，肥料的施加打破了原有物种间的作用关系。此外，施用寡糖肥料后土壤中弧菌属丰度增加明显，有报道显示该属细菌可通过形成生物膜对土壤物理结构产生影响，部分菌种具有病原性，且作为动物病原体能通过控制害虫数量来保护作物免受虫害[32]。光合细菌肥料的施用还提升了链霉菌属的丰富度，而链霉菌属往往被应用于生物防治和抑制病原菌[33]。综合以上结果可知，微生物肥料的施用也许能通过提升部分生防菌和促生菌的丰度，在一定程度上间接调控土壤的肥力和结构、抑制病原菌生长，从而达到促进植物生长的效果，但作用效果存在差异。
3.1.2 对根际土壤真菌群落的影响
对照组及各处理组之间在真菌门水平上主要由子囊菌门、担子菌门组成，子囊菌门占绝对优势，这与王义坤等[34]在研究菌肥对根际真菌群落的影响所得出的结论相同。子囊菌门的真菌通常形成与植物根系的共生关系，帮助植物从土壤中吸收养分[35]。壶菌门和担子菌门在土壤中的主要作用包括参与养分循环、改善土壤结构等[36]。3 组施肥处理都促进了子囊菌门真菌的生长，抑制了壶菌门真菌的生长。小球藻肥料的施用降低了担子菌门的丰度，另外 2 种肥料对担子菌门真菌的作用却与此相反。可以看出 3 种肥料的使用效果各有差异，在实际应用过程中要有针对性的选择适宜的微生物肥料，才能促进目标有益菌的生长并使其持续稳定地发挥生态作用，今后也可以围绕多种微生物肥料混施对土壤菌群结构的影响效果开展进一步的研究。
从根际真菌属水平来看，施用微生物肥料升高了棒孢菌属的丰度，降低了镰孢菌属的丰度。寡糖肥料组和光合细菌肥料组对前者作用效果明显，小球藻肥料对后者的作用效果最明显。镰孢菌属真菌作为植物病原体会影响植株的生长状况，如尖孢镰孢菌会引起香蕉枯萎病，属于土壤有害菌群[37]。施用小球藻肥料会提升小不整球壳菌属和半支亚门炭疽菌属的丰度。土壤中半支亚门炭疽菌属细菌主要通过其病原体形式对植物造成伤害，极易引起植物炭疽病[38]。这意味着在实际生产应用中施用小球藻肥料可能增加植株患真菌性疾病的风险。
3.2 施用微生物肥料对穿心莲根际土壤养分的影响
土壤肥力是土地生产力的重要指标之一，直接影响作物的生长发育和产品品质等[30]。穿心莲根际土壤理化性质分析结果表明，施加微生物肥料后的土壤与对照组相比，全氮含量均出现显著提升，此结果与常佳钰等[39]在探究光合细菌菌剂对黄芪土壤肥力的影响中得出的结论一致。其中施用小球藻肥后全氮含量提升最大，推测是由于肥料的施用促进了变形菌门、蓝细菌门以及子囊菌门等固氮菌的生长，从而使土壤中的氮素含量出现了显著增加，对于喜肥且对氮肥尤其敏感的穿心莲来说，这无疑会更有利于其生长。施用光合细菌肥料显著提高了土壤中的速效钾含量（P<0.05），该结果与王豹祥等[40]进行应用植物根际促生细菌菌肥以减弱化肥在烤烟生产中用量的研究相同。这可能由于施用菌肥后，根际促生细菌如假单胞菌属的假单胞菌、肠杆菌属的产气肠杆菌等，能够将土壤中的难溶性钾活化为易于植物吸收的有效钾，进而优化根际的微生态环境，增加土壤中速效钾的含量。这一过程有助于促进植物的生长和发育，从而提升作物的产量[41]。另外，施用微生物肥料后土壤中有效磷含量均呈现出不显著下降，结果与朱丹等[42]研究得出施菌肥能将有效磷含量显著提高 39.35% 不同。推断可能是因为 3 种生物液体肥的施用引起了土壤中可利用磷元素的流失，导致土壤环境中有效磷的含量减少，后期应用可以尝试改善浇灌方式，做好穿心莲种植区的水土保养工作。
3.3 微生物群落结构与根际土壤养分的相关性
植物根际土壤微生物与环境因子联系密切，微生物群落结构组成与微生物对环境因子的适应能力息息相关。经 RDA 可知，速效钾、碱解氮皆为穿心莲根际土壤微生物群落分布的核心驱动因子，与微生物群落组成有明显的相关性，这与曹彦强等[43] 和郭童鑫等[44]的研究结果吻合。Pearson 相关性分析发现，放线菌门与速效钾和有效磷呈显著正相关，芽单胞菌门与碱解氮呈显著正相关，担子菌门与速效钾呈极显著正相关。放线菌门可通过参与有机物的分解以及产生生物活性物质等方式影响土壤微生物群落结构组成，改善土壤环境，促进植物生长，提高植株抗病能力，在土壤生态系统中扮演者重要角色。芽单胞菌门部分物种可通过固氮作用促进植物生长，有些菌株则可以分泌抗生素，杀灭病原微生物，保护植物健康，从而被开发应用于植株疾病防治。担子菌门可有效分解复杂的有机物质，在土壤肥力维持和土壤结构改善方面发挥着不可或缺的作用。由此可见，碱解氮、速效钾和有效磷等速效养分的添加可增加穿心莲根际土壤中放线菌门、芽单胞菌门等有益菌的相对丰度，有利于穿心莲良好的根际微生态环境的构建，保障穿心莲植株健康生长。据报道，适当施用钾肥、磷肥可促进穿心莲生长，提升穿心莲品质[45-46]，这也验证了上述结论。总之，土壤养分与穿心莲根际土壤微生物的群落组成和丰度相互影响、相互调节，对改善土壤生态微环境有着重要意义。
4 结论
（1）施加微生物肥料后能显著提升全氮、速效钾含量，但土壤中可以利用的磷含量会因短期液体肥料的淋洒而出现部分流失。
（2）各施肥处理组均会提升土壤益生菌门类如变形菌门、子囊菌门、蓝藻细菌门的相对丰度，促进生防菌如链霉菌属、假单孢菌属细菌的生长，抑制病原菌如镰孢菌属真菌的生长。有益菌门及病原属的微生物丰度会因不同菌肥的施用会出现升高或降低的效果差异。
（3）穿心莲根际土壤理化因子与根际土壤核心微生物菌群相关性分析表明两者存在一定程度的相关性。
（4）施用微生物肥料对土壤微生物群落多样性的影响并不明显，但显著改变了土壤群落组成，具有一定的生态扰动作用，也可改善土壤的质量和肥力。