摘要
为探究养鸭废液的资源化利用，研究了葡萄糖添加量、料液比、培养时间对发酵后生物量的影响，通过单因素试验和响应面设计确定了最佳发酵条件。结果表明，在 30℃、130 r/min 条件下振荡培养，以 Saccharomyces cerevisiae W-1 为发酵菌株，确定最佳发酵条件为葡萄糖添加量、养鸭废液料液比和培养时间分别为 5.54%、1.5 和 72 h。在此条件下，养鸭废液发酵后化学需氧量去除率达到 82.84%，全氮增加量达到 57.04%。使用发酵液对水稻幼苗处理 15 d，在不同浓度水平下水稻幼苗均可正常生长，处理组的水稻各项指标均显著高于清水对照组，并呈现先上升后降低的趋势，在 60 倍的稀释倍数下为最大值，且株高、根总长、根表面积、根尖数、根总体积、干重以及叶绿素含量与其他处理组均存在显著差异。综上所述，该研究获得了高效的养鸭废液处理的发酵条件，并且相较于未发酵养鸭废液，发酵液对水稻的生长有一定的促生作用。
Abstract
In order to explore the resource utilization of duck waste liquid，the effects of glucose addition，solid-liquid ratio and incubation time on post-fermentation biomass were studied，and the optimal fermentation conditions were determined by single factor test and response surface design. The results showed that Saccharomyces cerevisiae W-1 was used as the fermentation strain at 30 ℃ and 130 r/min，and the optimal fermentation conditions were 5.54%，1.5 and 72 hours for glucose addition，duck waste liquid ratio and incubation time，respectively. Under these conditions，the removal rate of chemical oxygen demand reached 82.84% and the increase of total nitrogen reached 57.04% after fermentation of duck waste liquid. After 15 days of treatment with fermentation broth，the rice seedlings could grow normally at different concentration levels，and the rice indexes in the treatment group were significantly higher than those in the clear water control group，and showed a trend of first increasing and then decreasing，with the maximum value at the dilution factor of 60 times，and there were significant differences in plant height，total root length，root surface area，root tip number，total root volume，dry weight and chlorophyll content from other treatment groups. In summary，the fermentation conditions for efficient duck waste treatment were obtained，and compared with the unfermented duck waste liquid，the fermentation broth had a certain growth-promoting effect on the growth of rice.
在全球范围内，伴随着经济发展以及民众生活水平的提高，人们对于肉制品的需求量逐年增加，畜禽养殖规模也在随之扩大[1]，而肉鸭因其肉质好、饲养周期短等优点，在我国畜禽养殖业中占据着重要的地位。但随着肉鸭养殖的规模化、集中化，大量养殖废液得不到及时处理，造成了严重的环境污染问题[2]。如何将养鸭废液资源化利用以减少对环境的污染成为我国养殖业可持续发展中必须面对并解决的一个重大问题[3]。畜禽粪便富含多种营养物质，十分适宜微生物生长。因此，利用养殖废液进行微生物发酵生产微生物肥料，在减少环境污染、降低微生物肥料成本等方面均具有显著的优势[4]。有研究表明通过微生物处理畜禽养殖废液制成的微生物肥料不仅可以提供植物所需的全面营养，有效促进植物生长，还能改善土壤环境，大幅度提高农产品的品质与产量[5-7]。
酵母菌是一种分布广泛的单细胞真菌，属于异养兼性厌氧微生物，具有细胞大、代谢旺盛、对化学需氧量（COD）的去除速率较高、耐高渗透压等特性[8]，能够适应恶劣的生长条件实现自身的快速扩繁，被广泛地用于污水处理，尤其是对高浓度有机废水的处理[9-10]。此外，酵母菌还具有向植物提供可溶性营养、有机酸和植物激素的能力，在促进植物生长方面拥有巨大潜力，常作为微生物肥料的核心菌株，广泛应用于农业生产[11]，因此，利用养鸭废液发酵酵母菌生产微生物肥料对养殖废液的资源化利用以及绿色循环农业发展具有积极的影响。
本研究利用养鸭废液作为发酵底物，筛选能够在其中快速增殖的高效酵母菌，并以筛选菌株生物量为响应值，采用单因素试验以及响应面设计法优化了酵母菌在养鸭废液中的最适发酵条件，提高菌体生物量的同时去除污染物，并采用盆栽试验，探究发酵液对水稻的促生效果，以期为养殖废液的资源化、无害化处理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验材料与试剂
养鸭废液来源于内蒙古赤峰某养鸭场，使用前室温储存。供试土壤采自齐齐哈尔大学园艺棚室基地，试验水稻品种为‘龙粳 31’。养鸭废液理化性质见表1，土壤理化性质见表2。
表1养鸭废液理化性质
表2土壤理化性质
1.1.2 试验菌株及培养基
供试菌株为实验室保藏的 5 种酵母菌株。W-1、 W-3、W-4 和 W-2 由齐齐哈尔大学微生物实验室提供；W-5 为购于中国工业微生物菌种保藏管理中心的热带假丝酵母（Candida tropicalis）CICC1322。
酵母菌的传代在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD） 培养基中进行，所有酵母菌在 30℃、130 r/min 条件下培养 24 h 并储存在 4℃下。试验所需培养基见表3。
表3试验所需培养基
1.1.3 主要仪器与设备
研究级正置生物显微镜（OLYMPUS BX4，日本）；电热鼓风干燥箱（101-0AB，天津泰斯特仪器有限公司）；电子分析天平（JA1203，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-100G，上海博讯实业有限公司）；立式全温振荡培养箱（ZQLY-180V，上海知楚仪器有限公司）；双人净化工作台（SW-CJ-2D 型，浙江苏净化）。
1.2 试验方法
1.2.1 种子液的制备
将各菌株分别接种至装有 100 mL YPD 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，在 30℃，130 r/min 条件下活化，随后转接至装有 YPD 固态培养基的培养皿上，在 30℃条件下培养直至形成单菌落，挑取单菌落接种至 YPD 液体培养基中，扩培 2 d 后存放于 4℃中待用。
1.2.2 菌株鉴定
将所选试验室菌株接种于装有 100 mL YPD 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，30℃、130 r/min 条件下培养 24 h 后送至生工生物工程（上海股份有限公司），采用 26S rDNA D1/D2 区序列分析的方法对酵母菌进行分子生物学鉴定[12]。测序结果在 NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列同源性 BLAST 比对。采用 MEGA 11.0 构建系统发育树。
1.2.3 最佳发酵菌株的筛选
将菌种活化后，以 10% 的接种量分别接种于装有 100 mL 基础发酵培养基的 250 mL 锥形瓶中，在 30℃、130 r/min 条件下振荡培养 72 h，每 12 h 为一时间点对发酵样品取样检测发酵液活菌数，使用血细胞计数板[13-14]进行酵母菌活菌数的计算，并绘制各菌株的生长曲线。以发酵过程中最大生物量作为评价指标，筛选用于发酵的最佳酵母菌种，每组试验设置 3 次重复。
1.2.4 单因素试验
控制单一因素参数，以发酵过程中葡萄糖添加量（A）、养鸭废液料液比（水∶养鸭废液）（B）、培养时间（C）为单因素试验水平，以发酵后生物量为评价指标，考察其对发酵后养鸭废液中生物量的影响。固定葡萄糖添加量为 2%，发酵时间为 48 h，养鸭废液料液比为 0.75，改变其中一个水平因素，分别研究不同养鸭废液料液比（0、0.75、1.5、 2.25）、不同葡萄糖添加量（0%、2%、4%、6%）、不同培养时间（12、24、48、72 h）对发酵后活菌数的影响。
1.2.5 响应面优化试验
依据单因素试验结果，选取各因素最优点作为响应面的中心点以发酵后酵母菌的生物量为响应值，根据 Design-Expert 13.0.1 的 Box-Benhken 设计 3 因素 3 水平试验。试验结束后，对所得结果进行方差分析及二次回归拟合，建立平方项和任意 2 个因素之间的数学模型，研究各因素与响应值（发酵后活菌数）之间的关系，从而优化养鸭废液的液态发酵工艺确定最佳发酵条件。并根据响应面设计确定的最优参数进行验证试验，验证并分析试验结果。每组试验设置 3 个重复，响应面试验因素及水平设计如表4所示。
表4响应面试验因素水平表
1.2.6 水稻盆栽试验
通过盆栽试验，研究发酵后养鸭废液对水稻幼苗的促生效果。挑选籽粒饱满的水稻种子，在 75% 的酒精中消毒 5 min，用去离子水冲洗干净；再将水稻种子浸泡在 5% 的 NaClO 中消毒 3 min，用无菌蒸馏水冲洗干净，最后放入含无菌水浸湿的滤纸片的培养皿中。置于 30℃的恒温培养箱中避光催芽[15]。种子发芽后，挑选长势一致的水稻芽进行播种。
芽种播入预先准备好的直径 10 cm、高 10 cm 的营养钵，深度为 1～2 cm，清水将底土浇透成浆状并抚平，每盆播种 20 个种子，最后在表面覆过筛干土。试验设置 2 组处理，分别为清水对照组以及发酵后养鸭废液，并将发酵后养鸭废液设置为不同的稀释倍数：0、20、40、60、70、80、90，代码分别为 +0、+20、+40、+60、+70、+80、+90，每个处理 5 次重复。培养 15 d 后采样，通过测定以及分析水稻幼苗株高、根长等基本生长指标，从而选择出最佳的稀释倍数。
选择出最佳稀释倍数后，设置不同处理组（清水处理组和未稀释的养鸭废液作为对照组，未经稀释的发酵后养鸭废液、经 60 倍稀释的养鸭废液和60 倍稀释的发酵后养鸭废液作为处理组，代码分别为 Water、D0、+0、D60、+60），再次播种，其余条件同上。种植 15 d 后采样，测定水稻幼苗的基本生长指标，并对不同处理组的根系进行扫描并对得出的数据进行分析，测定叶片的叶绿素含量。
1.2.7 指标测定
COD 和铵态氮的测定依照《水和废水检验标准方法》[16]进行，全氮、全磷和速效钾的含量分别采用凯氏定氮法[17]、钼锑抗比色法[18]和火焰光度法[19]测定，pH 测定采用 pH 计法[20]，电导率测定使用电导率测定计法，根长、株高用直尺和数显游标卡尺测量[21]，植株干质量采用烘箱烘干后用天平测量[22]，叶绿素含量采用无水乙醇浸提法[23]测定，根系扫描用 Scan Maker i800 Plus 根系扫描分析系统测定。
1.2.8 数据统计与分析
使用 Design Expert 8.0.6 设计响应面试验。试验数据用 Excel 2021 进行处理，数据分析用 SPSS 27.0 进行。运用 GraphPad Prism 8.0.2 和 Origin 2022 进行制图。所有试验均进行 3 次平行试验。
2 结果与分析
2.1 最佳发酵菌株的筛选及鉴定
如图1a所示，确定 W-1、W-2、W-3、W-4、 W-5 这 5 株菌分别为 Saccharomyces cerevisiae、Candida tropicalis、Cyberlindnera jadinii、Trichosporon sp.、 Candida sp.。将酵母在酵母固体培养基上 30℃培养 24 h，长出单菌落，菌落形态如图1b所示，菌落不透明、圆形、乳白色，菌体为椭圆形，生殖方式为出芽生殖。
图1菌株的鉴定和形态学观察结果
注：a-基于 26S rDNA 序列建立的系统发育树；b-W-1 菌株菌落形态及细胞形态。
采用分批发酵的方法进行养鸭废液单酵母发酵试验。结果表明（图2a），在整个生长过程中，5 种酵母均呈现先上升后下降的趋势并分别在 12 或 24 h 时达到生物量的最大值。如图2b所示，菌株 W-1 在发酵过程中生物量的最大生物量显著高于其他组，说明其在养鸭废液中具有较强的适应性，并可以利用其中的营养物质进行自身繁殖，因此选择 W-1 为后续试验的发酵菌株。
图25 种酵母菌在基础培养基中的生物量
注：a-酵母菌的生长曲线；b-不同酵母菌发酵过程中生物量的最大值。柱上不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。
2.2 响应面法优化养鸭废液发酵参数
不同发酵条件的单因素试验结果如图3所示。养鸭废液中菌株 W-1 的生物量随着葡萄糖添加量的变化呈现先增加后降低的趋势，在葡萄糖添加量为 4% 时达到最高值（图3a）；生物量随着料液比变化而改变，以 0.75 为分界点呈现先升高后趋于平稳的状态（图3b）；生物量随着培养时间的增加而持续增长，在 72 h 时达到最大值，48 和 72 h 菌体生物量差异不显著（P>0.05），在进行大批量发酵时，发酵时间过长会提高发酵成本。因此，考虑到发酵成本问题，选择 48 h 为最佳发酵时间（图3c）。
图3不同发酵条件对 W-1 生物量的影响
注：a-葡萄糖添加量；b-料液比；c-培养时间。
2.3 响应面优化试验
使用 Design Expert 获得养鸭废液的发酵条件测试结果，其中葡萄糖添加量（A）、料液比（B）、培养时间（C）作为测试因子，以菌株 W-1 的生物量为响应值。响应面试验设计及结果如表5所示。由表5呈现的数据进行多元回归分析，获得了以酵母生物量与各因素回归方程：
(1)
由表6可知，模型的 F 值为 11.37，二次回归模型 P=0.0021<0.01，差异极显著；失拟项 P=0.9294，差异不显著（P>0.05），说明模型中没有异常的数据，模型建立成功。响应面的决定系数为 0.936，回归方程校正决定系数为 0.8537，说明试验模型的拟合度好，数据之间误差较小，能够对养鸭废液的条件进行分析预测。除此之外，方差分析的结果还显示，二次项中 B2 对生物量的影响显著（P<0.05），一次项中发酵料液比（B）对生物量的影响极显著（P<0.01）。根据 F 值可以判断，各因素对养鸭废液中生物量的影响程度顺序为料液比（B）>葡萄糖添加量（A）>培养时间（C）。综上所述，所得回归方程可以很好地用于养鸭废液中 W-1 菌体生物量的分析以及预测。
表5响应面试验结果
表6回归模型的方差分析
注：P<0.05 表示对结果有显著影响，P<0.01 表示对结果有极显著影响。 R2、R2 adj 分别为决定系数、校正决定系数。
根据图4可见，葡萄糖添加量、料液比、培养时间 3 个因素两两交互作用对生物量的增长均没有显著的影响（P>0.05）。结合模型结果和等高线得到提高生物量的最佳条件：葡萄糖添加量 =5.54%、料液比 =1.5、发酵时间 =66.097 h。在此条件下进行试验获得了 2.7667×108 cfu/mL 的生物量，与模型相似度为 89.2%，从而验证了预测结果。
2.4 养鸭废液发酵后指标的测定
在最佳发酵条件下，养鸭废液经过菌株 W-1 的处理后 COD 的去除效果较为显著，发酵结束后养鸭废水 COD 的去除率达 82.849%；同时全氮含量显著增加，增加量达到 57.043%（图5）。
2.5 养鸭废液对水稻促生作用的效果评价
2.5.1 不同稀释倍数下发酵后养鸭废液对水稻生长的影响
经发酵后养鸭废液的不同浓度水平处理 15 d 后，水稻均可正常生长（图6a）。将水稻幼苗的株高、根总长、根总体积、根尖数量、根总表面积、总鲜重、总干重 7 个生长指标进行综合分析（图6b），除去 +0 处理组外，其余处理组的各个生理指标均高于清水处理组，且呈现先上升后下降的趋势，在稀释倍数为 60 时对水稻幼苗的促生能力最佳。
2.5.2 发酵后养鸭废液对水稻生长和叶绿素含量的影响
由图7可知，+60 处理组与其他处理组（Water、 D0、+0、D60）相比均存在显著差异（P<0.05）。株高分别提高 4.224%、8.570%、3.282%、19.353%； 根总长分别增加 72.651%、47.857%、84.836%、49.444%； 根表面积分别增加 71.912%、49.952%、82.805%、 47.113%； 根总体积分别增加 74.983%、49.204%、 81.084%、49.342%；干重分别增加 7.957%、3.226%、 10.108%、66.022%。
2.5.3 发酵液对水稻叶绿素的影响
对水稻幼苗叶片中的叶绿素含量进行分析发现 （图8），经过发酵液处理的水稻（+0、+60），其叶片中叶绿素 a 含量均显著高于未经发酵的养鸭废液 （D0、D60）；此外，+60 处理组叶绿素 a 含量较清水对照组和养鸭废液处理组（D0、D60）存在显著差异，分别增加 18.578%、35.675%、55.070%；叶绿素 b 含量与其他处理组均存在显著差异，增加量分别为 14.842%、36.783%、26.639%、76.524%；总叶绿素含量显著高于清水对照组和养鸭废液处理组 （D0、D60），增加量为18.402%、35.924%、56.332%。
图4各因素间交互作用的响应面等高线图及响应面图3D 图
注：a-葡萄糖添加量与料液比对酵母活菌数的影响，b-葡萄糖添加量与培养时间对酵母活菌数的影响，c-料液比与培养时间对酵母活菌数的影响。
图5养鸭废液发酵前后化学需氧量、全氮、铵态氮的变化
注：NS 为无显著差异，**、*** 分别表示在 0.01、0.001 水平存在显著差异。
图6不同稀释比例发酵液对水稻生长的影响
注：a-不同稀释比例发酵液水稻幼苗的生长；b-不同稀释比例发酵液对水稻各项生理指标的综合影响。
图7不同处理组下的水稻生长情况
注：框上不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
图8不同处理组下水稻叶绿素含量
3 讨论
在畜禽养殖规模持续增长的趋势下，大量畜禽养殖废液在环境中大规模累积无法得到及时处理，已对环境造成严重的威胁。养殖废液因含有大量的有机废物等污染物常造成水体富营养化、土壤板结等环境问题，但其具有的营养成分十分适合微生物发酵生长，因此在废弃物资源化利用方面具有很大的潜力。近年来在对酵母菌深入研究的基础上，发现其在废弃资源物处理方面具有很大的潜力，现已成为废弃资源物转化再利用的常用菌株[24-26]。在本试验中，通过对不同菌株在养鸭废液中的生长情况进行筛选，发现 W-1 菌株具有最大生物量，能更好地适应养鸭废液中的环境进行生长，因此选择 W-1 作为发酵菌株。经鉴定发现该菌株属于 Saccharomyces cerevisiae，具有独特的代谢特性和生长优势，可以有效分解废弃资源物中的有机物，吸收不同来源的碳和氮，具有广泛的营养活性和易于增殖的能力[27-28]，这可能是该菌株能较好适应养鸭废液这一较为恶劣生存环境的原因。
微生物发酵过程中发酵条件对微生物的生长有决定性影响，为达到提高发酵后 Saccharomyces cerevisiae W-1 生物量的目的，本研究通过单因素试验以及响应面试验对其发酵条件中葡萄糖添加量、料液比以及培养时间进行优化。确定了最优发酵条件为葡萄糖添加量 5.54%、料液比 1.5、培养 72 h。有研究表明，Saccharomyces cerevisia 可以有效地转化葡萄糖，但不能利用乳糖和可溶性淀粉[29]，而葡萄糖由于来源广泛、价格稳定，并且易于吸收的同时还可以通过调节其浓度和添加方式有效地控制发酵过程中微生物的生长速率以及发酵效率，所以选择葡萄糖作为添加碳源。
料液比作为液态发酵条件优化中一个重要的参数，其直接影响了发酵底物的浓度以及可利用性。由于养鸭废液营养物质浓度高，且含有较多沉淀物，在充分搅拌的条件下也难以成为完全均匀介质，因此，每次发酵时的生物量无法进行横向对比。通过响应面分析可知，本研究中发酵过程中的料液比对发酵后微生物的生物量有极显著的影响。本研究显示，随着时间的增加，试验菌株 W-1 的生物量呈现持续累加的局势，并在 72 h 达到生物量的最大值。其原因可能是发酵培养基中剩余的营养成分仍可以满足菌株的生长需要，但考虑到发酵时间过长会增加发酵所需的成本，故将发酵时间固定在 48 h。
养鸭废液是禽畜养殖废液的主要来源之一，会对环境安全性造成严重威胁，大量未经处理的养鸭废液施入土壤后，其含有的有机物在分解过程中会消耗大量的氧气，引起土壤缺氧，从而影响土壤微生物的活性，破坏土壤结构及稳定性；其中的氨氮若未能采取有效的处理措施，对土壤、水源以及空气质量都有显著的影响[30]。微生物可以将养鸭废液中的氨氮和其他环境污染物质转化为自身生长所需要的氮源以及其他养料，在自我增殖的同时，去除养鸭废液中一定含量的污染物，使其能够作为微生物肥料从而用于促进植物生长。有研究表明，使用组合酵母发酵马铃薯淀粉加工废水在发酵后 COD 的去除率为 56.9%[16]，在本研究中，经发酵处理的养鸭废液 COD 的去除率可高达 82.849%。此外，全氮含量显著增加 57.043%，可能是酵母菌通过自身繁殖，将养鸭废液中的氮转化为自身组成中的氮。
使用处理畜禽粪便转化为微生物菌肥不仅能够缓解因粪污堆积带来的环境污染问题、还可以对植物起到更好的促生作用[4，31]。有研究表明，使用猪场废水发酵制成的微生物菌肥可显著提高小白菜的单株质量和产量[32]；施用牛粪发酵液能提高玉米干物质积累量，促进玉米的养分吸收，进而提高玉米产量[6]；宁夏沙地增施奶牛粪肥对玉米生长发育和产量有显著影响，随奶牛粪肥用量增加，各项指标均显著向好[7]。在本试验中，通过使用酵母菌对养鸭废液进行发酵，酵母在养鸭废液中不断增值，在提高其生物量的同时，不仅降低了其中的 COD 含量，并且将其发酵为对植物生长有一定促进作用的微生物菌肥。将稀释到不同浓度的发酵液分别施于水稻幼苗上，可以明显看到其对水稻的促生作用高于直接施加养鸭废液，对各项生长指标均有显著的促进作用；在叶绿素方面，经过酵母处理后的养鸭废液对其的促进作用也显著高于未经发酵的养鸭废液。
本研究以发酵后菌体生物量作为目标参数，筛选出了更能适应养鸭废水这一较为恶劣发酵环境的菌株 Saccharomyces cerevisiae W-1。利用单因素试验与响应面试验对发酵条件进行优化，优化后的各个参数：葡萄糖添加量 =5.54%、料液比 =1.5，培养时间 =72 h，在此条件下测得发酵后酵母菌的活菌数可达 2.7667×108 cfu/mL。并在发酵结束后对 COD 达到了 82.84% 的去除率。用发酵液浇苗对水稻的生长有一定的促进作用，选择出最佳的稀释比例为 60。本研究为养鸭废液的资源化利用提供了理论依据及技术支撑。