摘要
为合理利用和科学管理黑龙江省白浆土资源，探讨了不同土地利用方式对白浆土土壤细菌群落特征的影响。选取自然草地、水稻田和旱地为研究对象，采集 0 ～ 20 和 20 ～ 40 cm 土层的土壤样品，利用高通量测序技术对不同土地利用方式下白浆土土壤细菌群落的丰富度、多样性和群落组成的变化进行分析，结合白浆土理化性状，系统揭示不同土地利用方式下 0 ～ 20 和 20 ～ 40 cm 土层土壤细菌群落特征。结果显示，白浆土两土层间微生物 Alpha 多样性指数存在显著差异，不同土地利用方式下相较自然草地，水稻田和旱地的细菌多样性指数均显著降低；上层土壤细菌多样性显著高于下层土壤。OTU 富集情况在两土层中一致，均表现为自然草地 > 水稻田 > 旱地。白浆土细菌群落的主坐标分析以及层次聚类分析显示，自然草地与旱地的群落结构最为接近。冗余分析发现，土壤 pH 是驱动细菌群落结构变化的主要环境因子。链霉菌和亚硝化螺菌属主要富集在水稻田中，表明水稻田土壤氮循环能力强。本研究结果为白浆土土壤修复、病害防治及合理利用提供依据。
Abstract
In order to rationally utilize and scientifically manage the soil resources of Heilongjiang Province，this study explored the impact of different land use methods on the characteristics of the soil bacterial community in the soil. Natural grasslands，paddy fields and drylands were selected as the research objects. Soil samples were collected from the 0-20 and 20-40 cm soil layers. High-throughput sequencing technology was used to analyze the changes in the richness，diversity and community composition of the soil bacterial communities in white pulp soil under different land use modes. Combined with the physical and chemical properties of white pulp soil，the characteristics of the soil bacterial communities in the 0-20 and 20- 40 cm soil layers under different land use modes were systematically revealed. The results showed that there was a significant difference in the Alpha diversity index of microorganisms between the two soil layers of the white pulp soil. Compared with natural grasslands，the bacterial diversity index of paddy fields and drylands were significantly lower under different land use methods. The bacterial diversity of the upper soil layer was significantly higher than that of the lower soil layer. The OTU enrichment situation was the same in the two soil layers，both showing as natural grassland > paddy field > dry land. The principal coordinate analysis and hierarchical cluster analysis of the bacterial communities in the white soil showed that the community structure of the natural grassland was most similar to that of the dryland. Redundancy analysis found that soil pH was the main environmental factor driving changes in bacterial community structure. Streptomyces and Nitrosospira were mainly enriched in the paddy fields，indicating that the soil nitrogen cycle in the paddy fields was strong. The results of this study could provide a basis for soil remediation，disease control and rational utilization of white pulp soil.
土壤是陆地生态系统的重要组分，支撑着地球上超过 75 亿人的生计，是众多生态系统功能的基础，直接和间接影响人类的健康和福祉[1]。土壤微生物参与几乎所有土壤生态学过程，是维持土壤生态系统服务的“纽带”[2]。土壤微生物多样性和组成受到多种环境因素的影响，不同土地利用方式是关键影响元素之一。Peters 等[3]研究表明，在不同土地利用方式下土壤微生物群落特征存在差异。李懿等[4]针对四川省岷江流域紫红壤土不同土地利用方式进行了土壤微生物群落特征分析，研究表明，撂荒地土壤微生物多样性大于耕地。在黑龙江省的黑土土壤微生物研究中发现，在 4 种不同土地利用方式中水稻田土壤微生物多样性最低，而玉米田最高[5]。不同土地利用方式显著影响土壤性状和细菌群落组成及多样性[6]。陈义勇等[7]发现，土壤细菌数量及群落结构的变化能有效提高茶树对土壤养分的吸收利用，促进茶树生长，提高茶叶品质。明确土壤微生物群落特征及其对人类活动的响应，阐明不同土地利用方式下土壤微生物多样性的产生和维持机制[8-10]，有助于了解微生物在调节关键生态系统过程中的重要作用。但目前的研究对微生物群落的理解主要局限在表层（0～20 cm）土壤[11-12]，对深层土壤微生物群落的研究则相对不足[13]。有研究表明，随着土壤深度的增加，土壤微生物生物量显著下降[14]。Chu 等[15]研究发现，单个土壤剖面中垂直距离仅为 10～20 cm 的微生物群落差异与水平距离达数千公里的群落变化相对应，因此，研究垂直层面的土壤微生物多样性具有重要意义。
白浆土广泛分布于我国东北地区东部山间盆地和谷地，作为一种障碍性耕地土壤，由于其质地紧密，透水性差，导致旱涝灾害频发[16]。因此，如何合理利用白浆土、改善白浆土的土壤环境、提升作物产量是目前亟待解决的重要问题。本研究以白浆土的旱地、水稻田和自然草地 3 种土地利用方式为研究对象，利用高通量测序技术对 3 种土地利用方式下土壤细菌群落多样性、结构组成及分子生态网络进行测定，解析 3 种土地利用方式下两个土层土壤微生物群落多样性的变化，为后续基于生物定向调控土壤健康提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 土壤样本采集
试验地位于黑龙江省宝清县八五二农场 （46°14′21″N，132°38′13″E），年平均气温 2.6℃，年平均降水量 342～898 mm，土壤类型为草甸白浆土。采样时间为 2023 年 4 月 17 日，本研究选取旱地、水稻田、自然草地为供试土壤。在试验区内采用随机法采集 0～20 和 20～40 cm 土层深度的土壤样品，每 3 个土壤样品混为 1 个重复，每个处理采集 3 次重复，共采集土壤样品 18 份（3 种土地利用方式 ×3 次重复 ×2 个土层深度）。土壤样品去除杂物后过 2 mm 筛，放入带冰袋的保温箱中，带回实验室分为 3 份保存，一份保存于-80℃冰箱中用于提取土壤 DNA，另一份保存于-4℃冰箱中用于土壤酶活性测定，其余土样风干后测定土壤理化性质。
1.2 土壤理化性质与酶活性测定
土壤理化性质测定参照《土壤农化分析》[17]。土壤 pH 采用 pH 计（METTLER TOLEDO DELTA320） 按照土水比 1∶2.5 测定；总有机碳（TOC）采用重铬酸钾容量法-外加热法测定。全氮（TN）采用硫酸加速剂消煮后用 K360 全自动凯氏定氮仪测定。此外，利用碱性水解扩散法测定土壤碱解氮 （AN）；土壤全钾（TK）采用原子吸收光谱法测定； 土壤速效钾（AK）采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定；土壤全磷（TP）采用钼锑抗比色法测定；土壤有效磷（AP）采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法（Olsen 法）测定。
采用上海酶联生物科技有限公司土壤酶活性试剂盒测定土壤酶活性。本研究共测定了 4 种土壤胞外酶活性，分别为碳水解酶：β-葡糖苷酶、多酚氧化酶；氮降解酶：乙酰氨基葡糖苷酶；磷降解酶：酸性磷酸酶。采用酶标仪（BMG LABTECH， Germany）基于标准荧光法测定土壤中的 4 种水解酶活性。
1.3 土壤 16S rRNA 基因测序
使用通用引物 338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′）和 806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3～V4 区。在引物上游和下游的 5′末端各添加 8 bp 的特异标签序列（Barcode），以区分不同的样本。PCR 反应体系共 25 μL：包括 4× FastPfu Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、FastPfu Polymerase 0.5 μL、正向和反向引物各 0.5 μL（10 μmol/L）、土壤样品 DNA 1 μL 和 ddH2O 18.5 μL。反应条件为初变性 95℃ 5 min，然后是 28 个循环，变性 95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s 和延伸 72℃ 45 s，最后 72℃ 10 min。每个样品做 3 次重复，混合后使用 Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，Inc.，USA）核酸纯化试剂盒进行纯化。纯化后的产物由奥韦森公司（Beijing， China）进行双端测序分析。采用 QIIME2 软件对原始的数据序列执行质量监控。使用 Vsearch（Version 2.7.1）软件对 OTU 进行计算划分，并设定 97% 的阈值。此外，还利用 BLAST 算法[18]与 Silva 数据库进行比对，对物种进行注释。
1.4 数据处理与统计分析
为了比较样品间多样性和相对丰度的变化，每个样品按最小序列数（22355）进行抽平。Chao1 指数和 Shannon 指数[19]被用来表征细菌的 Alpha 多样性，利用 OTU 丰度表使用 R 软件计算得到数据在 Excel 中 3 个重复的平均值减去标准差为最终值[20]，采用 R 语言“ggplot2”包进行可视化。基于 SPSS 18.0，利用单因素方差分析（One-way ANOVA）计算差异显著性。
和弦图用于揭示门水平细菌群落差异，三元相图用于揭示细菌OTU 富集差异，使用R软件的“Ternary” 包、“circlize”包和“ggplot2”包实现（Version 3.4.2）。为了探究不同土地利用方式下两土层土壤细菌群落结构的差异及其主要影响因子，使用 R 的“vegan” 包进行主坐标分析（PCoA）和冗余分析（RDA）。此外，为了揭示土壤细菌间的相互作用，用 R 的 “WGCNA”包、“igraph”包和“Gephi”软件（version 0.10.1）对细菌 OTUs 进行网络分析及可视化并将每个土壤样品生成子网络计算拓扑性质。网络中更高的平均连接度表明环境中微生物相互作用的密度更高；较高的聚类系数表明节点与其邻居之间的联系紧密程度更高。较高的模块性表明更高的网络稳定性[21-22]。“Gephi”软件也被用来计算网络中节点的拓扑性质，包括节点的度、中介中心性。这些拓扑特征的值越高表明节点在网络中占据越核心的位置[23]。
土壤养分循环指数定量化，取每个样点的 9 个营养属性（TN、TP、AN、AP、TOC、β-葡糖苷酶、多酚氧化酶、乙酰氨基葡糖苷酶、酸性磷酸酶）进行归一化后数据计算[24]，采用 R 语言进行可视化，利用“ggpmisc”包进行土壤养分循环指数与细菌关键微生物之间的线性回归可视化[25]。
2 结果与分析
2.1 土壤理化性质
不同土地利用方式下的土壤理化性质如表1所示，在 0～20 cm 土层中，自然草地的全磷含量显著低于旱地和水稻田，水稻田处理的 pH 则显著低于旱地和自然草地，其他理化性质未见显著差异；20～40 cm 土层中，自然草地处理的 AN 和 TOC 含量显著低于旱地和水稻田，水稻田处理的 pH 则显著低于旱地和自然草地，TN、TP、AP 的含量在处理间差异显著，表现为水稻田 >旱地 >自然草地；其他理化性质未见显著差异。8 项理化指标在 0～20 与 20～40 cm 土层之间没有显著差异。
表1不同土地利用方式下土壤理化性质
注：CS 为旱地，RS 为水稻田，NS 为自然草地。表中数值为平均值 ± 标准差。同一列数值后的不同小写字母表示同一土层不同土地利用方式间差异显著（P<0.05）；同一列数值后的不同大写字母表示同一土地利用方式不同土层间差异显著（P<0.05）。
2.2 土壤细菌群落多样性
不同土地利用方式下土壤细菌 Alpha 多样性指数变化关系见图1。在两个土层中，自然草地处理的土壤细菌 Chao1 指数和 Shannon 指数均显著高于旱地和水稻田处理（P<0.05）。在自然草地处理中，0～20 cm 土层土壤细菌的 Chao1 与 Shannon 指数均显著高于 20～40 cm 土层土壤（P<0.05）；旱地处理的土壤细菌 Chao1 指数和 Shannon 指数在两个土层中均无显著差异；在水稻田处理中，0～20 cm 土层土壤细菌的 Chao1 指数与 Shannon 指数显著高于 20～40 cm 土层土壤（P<0.01）。
图1不同处理对细菌 Alpha 多样性的影响
注：CS 为旱地，RS 为水稻田，NS 为自然草地。下同。大写字母代表 0～20 cm 土层中 3 个处理之间差异显著，小写字母代表20～40 cm 土层中 3 个处理之间差异显著。* 代表同一个处理中两个土层之间的差异显著（P<0.05），** 代表同一个处理中两个土层之间的差异显著（P<0.01）。
基于 Bray-Curtis 距离的 PCoA 分析结果（图2） 可知，土壤细菌群落显著分为 0～20 和 20～40 cm 土层两大集群，表明不同土层对细菌群落结构的影响大于不同土地利用方式。此外，在两个土层中，自然草地、旱地和水稻田处理的微生物群落各自聚集，说明不同土地利用方式下土壤细菌群落结构存在显著差异（P<0.05）。
基于 RDA 分析探究驱动不同土地利用方式下土壤微生物群落发生变化的主要环境因子见图2。在 0～20 cm 土层土壤中，土壤细菌的 RDA 第一轴和第二轴的解释率分别是 23.54% 和 8.95%，各个环境因子对 0～20 cm 土层土壤细菌群落驱动程度大小为 pH>TK>AP>TOC>AN>AK。在 20～40 cm 土层土壤中，土壤细菌的 RDA 第一轴和第二轴的解释率分别是 29.0% 和 11.5%，土壤 pH 是影响细菌群落最重要的因子。
图2不同处理细菌群落结构的主坐标分析及冗余分析
注：AN 为碱解氮，TOC 为总有机碳，AP 为全磷，TN 为全氮，AK 为速效钾。
2.3 土壤细菌群
由和弦图3a、b可知，在门水平上，3 种不同土地利用方式下的土壤中微生物优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、放线菌门（Actinbacteriota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）和疣微菌门 （Verrucomicrobiota）。在 0～20 cm 土层土壤中，与水稻田、旱地处理相比，自然草地处理中芽单胞菌门、酸杆菌门和变形菌门相对丰度较高。在 20～40 cm 土层土壤中，与自然草地、旱地处理相比，水稻田处理中放线菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门相对丰度较高。
由三元相图3c、d可知，0～20 cm 土层中自然草地处理的 OTU 富集数量为 1114，水稻田处理为 917，旱地处理为 762，OTU 富集数量表现为自然草地 >水稻田 >旱地；20～40 cm 土层中自然草地处理的 OTU 富集数量为 884，水稻田处理为 828，旱地处理为 645，OTU 富集数量表现为自然草地 >水稻田 >旱地。0～20 cm 土层土壤细菌 OTU 富集总数量大于 20～40 cm 土层。
2.4 土壤细菌群落网络结构和关键微生物
本研究基于 OTUs 水平的网络分析揭示了不同土地利用方式下土壤细菌群落的相互作用（图4）。网络分析结果表明，0～20 cm 土层土壤中细菌网络的 nodes 和 edges 数值显著高于 20～40 cm 土层土壤。此外，对不同土地利用方式间细菌网络进行分析发现，在 0～20 cm 土层土壤中，水稻田和自然草地处理的 degrees 数值显著高于旱地处理，旱地处理的中介中心性数值显著高于水稻田和自然草地处理。在 20～40 cm 土层土壤中，nodes 数值大小顺序为自然草地 >旱地 >水稻田，水稻田和自然草地处理的 degrees 数值显著高于旱地处理，旱地处理的中介中心性数值显著高于水稻田处理和自然草地处理。由 nodes 数值、degree 数值和中介中心性综合分析发现，水稻田、自然草地处理网络复杂性大于旱地处理，两个土层情况一致。
图3分析土层与处理中的优势菌门及细菌 OTU 富集的差异
图4不同处理下土壤细菌网络分析
注：node 代表 OTU，edge 代表 OTU 之间的显著相关性，中介中心性代表以经过某个节点的最短路径数目来刻画节点重要性的指标；图中大写字母表示同一土层中不同处理间差异显著（P<0.05）。
本研究把土壤细菌门水平上相对丰度排名在前 5 的 OTUs 认定为关键微生物类群。由表2可知，0～20 cm 土层土壤中的关键类群分别为 OTU 20553（Bryobacter）、OTU 14985（Streptomyces）、OTU 19517（Bellilinea）、OTU 442（Carboxydothermus） 和 OTU 16453（Terriglobu）。20～40 cm 土层土壤中的关键类群分别为 OTU 4007（Brevitalea）、OTU 19666 （Pseudacidobacterium）、OTU 1208（Nitrosospira）、 OTU 93（Vitiosangium）和 OTU 9371（Brevitalea）。在 0～20 cm 土层土壤中水稻田主要富集关键微生物有 OTU 14985（Streptomyces）、OTU 19517（Bellilinea）、OTU 442（Carboxydothermus） 和 OTU 16453（Terriglobu），自然草地主要富集 OTU 20553（Bryobacter）； 在 20～40 cm 土层土壤中自然草地、水稻田主要富集关键属，自然草地中主要富集 OTU 4007（Brevitalea）、 OTU 19666（Pseudacidobacterium），水稻田中主要富集 OTU1208（Nitrosospira）、OTU 93（Vitiosangium）。
由图5可知，在 0～20 cm 土层土壤中，自然草地、旱地和水稻田多重养分循环指数没有显著差异，在 20～40 cm 土层土壤中，旱地、水稻田多重养分循环指数处理显著高于自然草地。分析多重养分循环指数与关键物种之间相关性可知，土壤细菌群落关键物种相对丰度与土壤养分循环指数呈显著正相关（P<0.05）。
表23 种土地利用方式下两个土层中微生物群的指示类群
注：表中同列不同小写字母表示同一土层不同处理间差异显著（P<0.05）。
图5养分循环指数与微生物群落关键属的垂直距离衰减关系
注：大写字母表示 0～20 cm 土层不同处理间差异显著（P<0.05）；小写字母表示 20～40 cm 土层不同处理间差异显著（P<0.05）。
3 讨论
许多研究表明，土地利用方式是影响土壤细菌多样性的重要因素之一[26]。Chao1 指数在生态学中作为度量物种丰富度的指标，其值越高代表群落物种越丰富。Shannon 是用来计算菌群多样性的指数，常用于反映 Alpha 多样性，用来估算样本中的微生物多样性，同时考虑了物种丰富度以及均匀度[27]。本研究发现，自然草地土壤细菌 Chao1 指数和 Shannon 指数显著高于旱地和水稻田，同样地，在辽宁省西北丘陵地区的研究[28]也发现，农田土壤细菌的 Alpha 多样性低于草地。这可能是由于草地上的杂草种类繁多，植物残体和凋落物的成分丰富，而农田土壤因受到频繁犁地、施肥等其他农艺措施影响，导致土壤团聚体质量下降[29]，从而导致微生物多样性降低。此外，本研究也发现，下层土壤的 Alpha 多样性显著低于上层土壤。出现这种现象的原因可能是土壤上层中可利用资源较丰富，提供给微生物良好的环境，使得多样性指数较高。相反，深层土壤中可利用资源减少，细菌群落竞争大，多样性指数降低。通过 RDA 分析表明，土壤 pH 是调节两个土层土壤细菌群落的主要因子。这一结果与许多研究结果一致；土壤 pH 是作为土壤微生物群落变异的主要驱动因子已经被广泛报道[30-32]； 在已酸化黄壤土的研究[33]中表明，土壤 pH 是影响微生物代谢活性和群落多样性变化的主要因素之一。
对比两个土层发现，变形菌门和酸杆菌门均是 0～20 cm 土层比 20～40 cm 土层土壤细菌相对丰度高。出现这种现象的原因可能是变形菌门作为富营养菌门，其对环境适应力强，可在高养分条件下迅速繁殖[34]，由于 0～20 cm 土层土壤输入动植物残体量高于 20～40 cm 土层土壤，所以出现 0～20 cm 土层土壤中变形菌门相对丰度较高的情况。有研究发现酸杆菌对土壤酸度敏感，其相对丰度随着 pH 值的降低而增加[35]。类似的，本研究中 0～20 cm 土层土壤 pH 值比 20～40 cm 土层低，出现酸杆菌门在 0～20 cm 土层土壤富集较多的现象。本研究还发现，芽单胞菌门和疣微菌门均是 20～40 cm 土层土壤比 0～20 cm 土层土壤高。许多研究结果表明，芽单胞菌门和疣微菌门能够分泌胞外多糖等粘结物质，出现这种现象可能是深层土壤养分稀缺，生存环境恶劣，芽单胞菌门和疣微菌门产生胞外多糖等粘结物质利于细菌的生存，比其他菌群更适应恶劣的生存环境[36-37]。
对比同一土层不同土地利用方式，研究发现放线菌门在水稻田和旱地相对丰度最高。出现这种现象可能是水稻田和旱地比自然草地的生物量含量高、植物残体较多，由于放线菌具有降解碳氢化合物的能力，降解碳能力强，在植株腐解过程中发挥着重要作用[38-39]，因此出现这种现象。本研究发现，芽单胞菌门在水稻田和旱地相对丰度最高，这一结果与前人研究结果一致。许多研究表明，芽单胞菌门在农田土壤中含量非常高，可能是因为芽单胞菌门在养分循环和改善土壤肥力中起重要作用[40]，相同的，在辽西北的研究[41]发现，农田土壤中芽单胞菌相对丰度较高，可能是因为芽单胞菌对有机污染物有降解作用[42]，能降解农田土壤中的农药残留，相较自然草地，农田土壤农药残留高，因此，农田土壤中芽单胞菌门相对丰度高。
本研究对比两个土层细菌网络结构发现， 0～20 cm 土层土壤网络结构比 20～40 cm 土层更加复杂，可能是由于 0～20 cm 土层土壤营养物质多、透气性好，随着土壤深度增加资源减少、含氧量减少，从而使下层土壤网络复杂性和紧密性降低。对比同一土层中不同土地利用方式，发现自然草地和水稻田的细菌网络复杂性显著高于旱地。类似的，杨贤房等[43]的研究发现，耕地土壤细菌共现网络负相关比例高于植被、裸地，在资源相对匮乏的土壤中，细菌更易增加合作来分解、合成难以利用的物质[44]。
本研究中门水平相对丰度排名在 0～20 cm 土层土壤的关键属 OTU 20553 苔藓杆菌（Bryobacter）、 OTU 14985 链霉菌属（Streptomyces）和 20～40 cm 土层土壤关键属 OTU 1208 亚硝化螺菌属（Nitrosospira） 是有益菌。其中，苔藓杆菌是一种好氧化学有机营养细菌，可以利用各种糖和有机酸[45-46]，苔藓杆菌还被称为有机质分解者[47]，在碳循环中起着重要作用，在本研究中苔藓杆菌主要富集在自然草地中，这表明草地中物种丰富的植物群落在没有人为干扰的情况下可能有助于土壤有机碳的积累，自然草地土壤有机质丰富、含碳量高更支持微生物群落生长，自然草地土壤更肥沃；有研究表明，链霉菌属是真菌拮抗剂和植物生长促进剂，已发现它们在不同程度上保护各种植物免受土传真菌病害的侵害[48-50]； 亚硝化螺菌属多为氮循环功能菌，其通过丰度增加进而加快土壤氮素的代谢和利用，减少氮素损失，在土壤碳、氮循环以及磷等营养物质转化过程中发挥着积极作用，有利于植物的生长[51]。本研究中，链霉菌和亚硝化螺菌属主要富集在水稻田中，这表明水稻田土壤氮循环能力强，土壤氮组分和微生物生态对土地利用变化的响应将对未来农业变化下土壤氮的保持或流失产生深远的影响。
4 结论
针对黑龙江省白浆土区的自然草地、旱地和水稻田 3 种土地利用方式，分析了 0～20 和 20～40 cm 土层的微生物群落及土壤理化性质。研究发现，旱地和水稻田中的土壤细菌群落多样性均显著降低，同时上层土壤细菌 Alpha 多样性指数显著高于下层土壤。不同土地利用方式对土壤细菌群落结构有显著影响。RDA 分析表明，pH、AN、AP、TOC 是影响上下两土层细菌群落结构的关键因子，其中 pH 值是主要驱动因子。对细菌门水平群落结构进行分析发现，变形菌门、酸杆菌门和放线菌门为主要优势菌门。在 3 种土地利用方式中，水稻田土壤的关键属有益菌富集最多，土壤氮循环微生物群落富集，说明水稻田土壤氮循环能力强。本研究利用高通量测序技术，提供了白浆土土壤细菌群落多样性受不同土地利用方式影响的实例。
