摘要
研究不同施氮量对土壤磷转化的影响及其微生物机制，为马铃薯生产中养分优化管理提供理论支撑。马铃薯连作体系氮肥管理试验于 2017 年在内蒙古自治区武川旱作试验站开展，设置 4 个处理：NE（肥料用量用 NE 推荐确定）、NE-N、NE-1/2N、NE+1/2N。于 2023 年马铃薯收获期采集各处理 0 ～ 20 和 20 ～ 40 cm 土壤样品以及秸秆和块茎样品，分析土壤氮磷含量、磷酸酶活性及其编码基因丰度，植株与块茎磷吸收。与 NE-N 处理相比， NE-1/2N、NE 和 NE+1/2N 处理 0 ～ 20 cm 土壤全磷、有机磷和有效磷分别降低了 10.0% ～ 20.3%、7.5% ～ 18.8% 和 38.9% ～ 52.7%，而在 20 ～ 40 cm 土层仅有有效磷显著降低了 17.4% ～ 25.1%。随氮肥用量的增加，0 ～ 20 cm 土壤氮磷比（N/P）逐步增加、pH 逐步降低，而亚表层土壤 N/P 和 pH 无显著变化。土壤碱性磷酸酶活性及其编码基因 phoD 和 phoX 丰度随着施氮量的增加呈先增加后降低的趋势，在两土层中均以 NE 处理最高，且同处理亚表层土壤碱性磷酸酶活性均高于表层。所有处理同层土壤 phoD 的基因丰度均高于 phoX。相关分析表明，土壤 phoD 和 phoX 基因丰度和碱性磷酸酶活性均与土壤有效磷呈显著负相关。总之，在干旱半干旱地区的马铃薯生产中优化氮肥用量有利于土壤磷素转化利用。
Abstract
Studying the effect of different nitrogen（N）application rates on soil phosphorus（P）transformation and their microbial mechanisms could provide theoretical support for optimal nutrient management in potato production. The N fertilizer management experiment of potato continuous cropping system was conducted in 2017 at the Wuchuan Dryland Experiment Station in Inner Mongolia Autonomous Region，four treatments included NE（fertilizer dosage recommended by NE ）， NE-N，NE-1/2N，and NE+1/2N. Soil samples in the 0-20 and 20-40 cm soil layers，and potato straw and tuber in each treatment were collected at potato harvest period in 2023，soil N and P contents，phosphatase activity，and the abundance of its encoded genes，and P uptake in potato straw and tuber were determined. Compared with the NE-N treatment，the NE-1/2N，NE，and NE+1/2N treatments reduced total P，organic P，and available P of the 0-20 cm soil layer by 10.0%-20.3%， 7.5%-18.8%，and 38.9%-52.7%，respectively. However，only available P significantly decreased by 17.4%-25.1% in the 20-40 cm soil layer. With the gradual increase of N fertilization rates，the N/P ratio of 0-20 cm soil layer gradually increased and the pH gradually decreased，while there was no significant change in the N/P ratio and pH of surface soil. The activity of soil alkaline phosphatase and the abundance of its encoded genes phoD and phoX showed an increased and then decreased change with the increasing N application rates. The NE treatment had the highest alkaline phosphatase activity in both soil layers，and the activity in the 20-40 cm soil layer was higher than that in the 0-20 cm soil layer in the same treatment. The phoD presented higher abundance than phoX in the same soil layer. Correlation analysis showed that the abundance of soil phoD and phoX genes and alkaline phosphatase activity were significantly negatively correlated with available P content. In summary，optimizing N fertilization was beneficial for soil P conversion and utilization in potato production in arid and semiarid regions.
Keywords
磷素是植物生长所必需的重要营养元素，也是农业生产中的主要限制因素之一[1]。土壤磷主要以无机磷和有机磷形式存在，有机磷所占比例较大（30%～65%），且不能被作物直接吸收利用[2]。土壤有机磷通过矿化转化为有效态磷（H2PO4- 或 HPO4 2-），可以直接被作物和微生物吸收。研究表明，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是与土壤有机磷矿化有关的两种关键酶[3]。酸性磷酸酶主要由植物根系产生，在酸性环境中占主导地位；而碱性磷酸酶主要由土壤微生物产生，在中性至碱性环境中活性最佳。此外，与酸性磷酸酶相比，碱性磷酸酶具有更广泛的底物特异性和更高的催化效率[4-5]。细菌已被证明可以诱导微生物产生碱性磷酸酶，且 phoD、phoA 和 phoX 为编码磷酸单酯酶的 3 个同源基因[2]。相对其他磷酸酶编码基因，phoD 基因的丰度较高，通常被用作表征与有机磷矿化有关的微生物群落的生物标志物，phoX 是仅次于 phoD 的土壤中碱性磷酸酶的第二大贡献者[6-7]；而 phoD 和 phoX 基因丰度易受到环境条件、土壤肥力和肥料投入的影响[8]。农田土壤中，施肥是影响土壤磷素积累转化的重要因子，施氮可通过改变土壤性质、微生物群体组成和活性间接改变土壤磷素存在形态和循环特征。王艳杰等[9]研究指出，在全球范围内，氮肥施用通过提高土壤碱性磷值酸酶活性（8.8%）促进有机磷的矿化。Chen 等[10]研究发现，长期施用氮肥通过降低土壤 pH 影响含有 phoD 基因的细菌群落结构和碱性磷酸酶活性。此外，土壤有机磷矿化相关酶（碱性磷酸酶）活性和关键基因（phoD 和 phoX）丰度是评价土壤肥力和指导施肥的常用指标。因此，本研究基于内蒙古自治区 6 年的马铃薯连作田间定位试验，研究不同施氮量如何影响土壤磷含量及关键磷酸酶编码基因丰度的变化，以及关键磷酸酶编码基因对土壤磷素的调控作用，为该区域马铃薯生产中氮、磷养分的优化管理提供支撑。
1 材料与方法
1.1 试验地点
氮肥量级定位试验于 2017 年 5 月在内蒙古农牧业科学院武川旱作试验站（41°14′N，111°30′E） 进行。该地区气候类型为中温带半干旱大陆性季风气候，海拔 1576 m，年均气温 3.0℃，年均降水量 280 mm，无霜期 105 d。当地土壤类型为栗钙土，土壤砂粒、粉粒和黏粒含量分别为 74%、17% 和 9%。2017 年试验开始前 0～20 cm 耕层土壤基础理化性质如下：pH 8.71（土水比 1∶2.5），有机质 19.0 g·kg-1，硝态氮（NO3--N）12.5 mg·kg-1，铵态氮（NH4 +-N）0.5 mg·kg-1，有效磷 29.8mg·kg-1，速效钾 150 mg·kg-1。
1.2 试验设计
田间试验为马铃薯连作，共设置 4 个处理：NE （N 178 kg·hm-2，肥料用量基于马铃薯养分专家系统的肥料推荐值）[11-12]、NE-N（不施氮肥）、NE-1/2N （N 89 kg·hm-2）和 NE+1/2N（N 267 kg·hm-2）。试验所用氮、磷、钾肥分别为尿素（N 46%）、过磷酸钙 （P2O5 14%）和氯化钾（K2O 60%），所有处理磷、钾肥用量分别为 P2O5 86 kg·hm-2 和 K2O 135 kg·hm-2。所有处理均采用随机区组排列，3 次重复，小区面积为 30 m2 （7.5 m×4 m）。基肥条带施用，同时播种马铃薯。磷肥以 1∶1 在播前和苗期追肥；氮肥和钾肥均按照 1∶1∶1∶1 于苗期、开花期和盛花-成熟期分别进行追肥，追肥方式均为滴灌施入。马铃薯品种为华颂 7 号，采用高垄种植，垄上滴灌，马铃薯于 5 月初种植，行距 100 cm，单垄单行，株距 20 cm，每行 37 株，9 月中旬收获。整个生育期灌溉 5～6 次，总灌水量 1500 m3 ·hm-2。马铃薯成熟后，将植株残留物粉碎还田于土壤中。
1.3 样品采集
于 2022 和 2023 年收获期（9 月 20 日和 25 日） 每小区采取马铃薯植株样 5 株，2023 年马铃薯收获期采集各小区 0～20 和 20～40 cm 土层的土壤样品，每个小区随机采集 5 个样点并混合成一个复合样品。植株样切成段 / 片烘干后粉碎，土壤样捡除杂质后过 2 mm 筛混合均匀。新鲜土壤样品立即测定碱性磷酸酶活性，一部分保存于-80℃用于后续 DNA 提取和 qPCR，一部分土样风干用于土壤全磷、有机磷、有效磷、全氮和 pH 的测定。
1.4 样品分析
植株和块茎样品经浓硫酸-双氧水消煮后用钼黄比色法测定磷含量；土壤全磷采用高氯酸-浓硫酸消煮，钼锑抗比色法测定；土壤有效磷采用 0.5 mol·L-1 NaHCO3 溶液浸提-钼蓝比色法测定[13]；土壤有机磷采用灼烧法测定[14]；土壤碱性磷酸酶活性通过荧光微型板酶检测技术进行测定。
phoD、phoX 基因丰度采用实时荧光定量 PCR 法测定。具体步骤：使用 FastDNA® Spin Kit（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，United States）试剂盒从 0.5 g 土壤样品中提取土壤 DNA，用 1% 琼脂糖凝胶电泳检验 DNA 提取质量，然后使用 NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国） 测定所提取 DNA 样品的纯度和浓度。引物使用 ALPS-F730（5′-CAG TGGGACGACCACGAGGT-3 ′） 和 ALPS-R1101（5′-GAGGCC GATCGGCATG-3′）扩增 phoD 基因，扩增片段大小为 385 bp；使用 PHOXF （5′-GARGAGAACWTCCACGGYTA-3′）和 PHOX（5′-GATCTCGATGATRTGRCCRAAG-3′），扩增片段大小为 400 bp。每个 PCR 反应的体系为 20μL，包含 10μL 的 2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.4μL 的 ROX Reference Dye I（50×），正向引物和反向引物分别为 0.8μL，加入 1μL 的 DNA 模板和 6 μL ddH2O。qPCR 的扩增条件为：95℃ 3 min，之后的 40 个循环的反应条件为 95℃ 5 s，58℃ 30 s 和 72℃ 1 min。使用 Miniprep 试剂盒（Qingen，Germantown， MD，USA）从克隆中获得质粒 DNA。使用线性化质粒 DNA 的 10 倍稀释系列生成 phoD 和 phoX 基因片段标准曲线，拷贝数从 101 到 108 μL-1[15]。两个基因的 PCR 效率在 85.6%～104.9%，R2 值均高于 0.99。 qPCR 中每个样品按 3 个重复进行。
1.5 数据统计与分析
采用 Excel 2016 对试验数据进行整理。采用 SPSS 24.0 对不同处理下土壤全磷、有效磷、有机磷、碱性磷酸酶活性和 phoD、phoX 基因丰度等进行单因素方差分析（ANOVA），采用最小显著差异（LSD）（检验水准 P=0.05）进行 Duncan’s多重极差检验，评价不同施肥处理间的差异。同时采用 Origin 2024 绘制相关性热图。
2 结果与分析
2.1 氮肥用量对土壤磷含量的影响
施氮显著影响土壤全磷、有效磷和有机磷含量 （P<0.05）。从图1可知，与 NE-N 处理相比，土壤全磷、有机磷和有效磷含量均随氮肥用量的增加而逐步降低，0～20 cm 土层的全磷、有机磷和有效磷分别降低了 10.0%～20.3%、7.5%～18.8% 和 38.9%～52.7%，而在 20～40 cm 土层仅有有效磷显著降低了 17.4%～25.1%。对于不同氮肥处理，NE 与 NE-1/2N 处理间两土层的全磷和有机磷含量无显著差异，而其他处理 0～20 cm 土层的有机磷含量均高于 20～40 cm 土层。0～20 cm 土壤氮磷比随氮肥用量的增加逐步增加，而不同处理 20～40 cm 土层的氮磷比差异不显著 （图1d）。NE+1/2N 较 NE-1/2N 处理显著降低 0～20 cm 土壤 pH，而氮肥用量对 20～40 cm 土层 pH 影响不显著（图1e）。
图1不同施氮量下土壤全磷、有效磷、有机磷、氮磷比和 pH
注：不同小写字母表示同土层不同氮肥用量处理间差异显著（P<0.05）。下同。
2.2 不同处理磷的投入与移出平衡
与 NE-N 相比，马铃薯对磷素的吸收量随着施氮量的增加而增加，NE 处理吸磷量最高 （15.7 kg·hm-2）（ 图2a）。磷肥投入和作物磷吸收的平衡显示，不施氮肥处理的磷肥盈余量最高 （23.9 kg·hm-2），土壤磷盈余量随着施氮量的增加逐步降低（图2b）。
图2不同施肥处理马铃薯磷吸收量和磷投入与作物磷吸收的平衡
注：磷肥投入与作物磷吸收的平衡 = 肥料磷投入 + 前茬马铃薯秸秆磷投入-马铃薯秸秆和块茎磷吸收量。
2.3 氮肥用量对碱性磷酸酶活性的影响
图3表明，土壤碱性磷酸酶活性随着施氮量的增加呈先增加后降低的趋势，在 0～20 和 20～40 cm 土层均以 NE 处理最高，分别为 221.0 和 235.5 nmol·h-1·g-1。同处理亚表层土壤碱性磷酸酶活性均高于表层土壤。
2.4 氮肥用量对土壤磷转化关键酶编码基因 phoD 和 phoX 丰度的影响
phoD 和 phoX 基因丰度均随着施氮量的增加呈现先增加后降低的趋势，在两土层中均以 NE 处理最高（图4）。在 0～20 cm 土层，NE 处理 phoD 基因丰度显著高于其他处理，但其他各处理间无显著差异。phoX 基因丰度在 NE-N 与 NE-1/2N 处理间无显著差异，但 NE+1/2N 处理显著低于其他处理（20～40 cm 土层除外）。NE 处理亚表层土壤 phoD 基因丰度和 NE-1/2N 处理亚表层土壤 phoX 基因丰度均高于其同处理表层的丰度。NE-N 处理亚表层土壤的 phoD 和 phoX 基因丰度均显著低于表层土壤。所有处理同层土壤 phoD 的基因丰度均高于 phoX。
图3不同施肥处理土壤碱性磷酸酶活性
图4不同施肥处理 phoD 和 phoX 基因丰度
2.5 土壤磷含量、碱性磷酸酶活性及磷酸酶编码基因丰度的相关关系
相关性分析表明，碱性磷酸酶活性与 phoD、 phoX 基因丰度呈显著正相关，而土壤有效磷含量与 phoD、phoX 基因丰度和碱性磷酸酶活性呈负相关（图5）。表层土壤中，土壤全磷与有效磷含量间呈正相关关系，碱性磷酸酶活性与 phoD、phoX 基因丰度均呈极显著正相关，且 phoD 基因丰度的相关性较 phoX 基因丰度更强。在亚表层土壤中，有机磷含量与 phoX 基因丰度呈显著正相关。
图50～20 和 20～40 cm 土层磷含量、碱性磷酸酶活性及磷关键基因丰度间的相关性
注：a 为 0～20 cm 土层，b 为 20～40 cm 土层；* 表示指标间显著相关（P<0.05），** 表示指标间极显著相关（P<0.01），*** 表示指标间极显著相关（P<0.001）。
3 讨论
3.1 氮肥用量对土壤磷含量和磷平衡的影响
马铃薯是一种浅根系植物，其根系主要分布在表层土壤[16]，这导致表层土壤的磷含量波动较大。本研究结果表明，土壤全磷含量在 NE-N 处理中最高，在 NE+1/2N 处理中最低；这是因为土壤全磷受磷肥投入和作物收获移走影响，在磷肥投入相同情况下，作物收获对磷的吸收携出是土壤磷素减少的主要途径[14]，而氮肥施入会促进作物的生长发育而增加对磷素的吸收。土壤有效磷是植物可直接被吸收利用的磷，其含量容易受环境因素和管理因素影响[17]，施氮量也是重要的影响因素。本研究中土壤磷平衡均为正值，而土壤全磷和有效磷含量随着施氮量的增加而显著降低，且表层土壤有效磷含量除 NE-N 处理均低于试验开始前的含量。因为一是试验前当地农民施磷量高达 P2O5 172.5 kg·hm-2[18]，远高于本研究中的P2O5 86 kg·hm-2，长期高磷施用下导致试验土壤磷含量极高；二是试验中高氮用量下马铃薯块茎磷吸收移走增加，增加了土壤磷消耗；三是试验地土壤含砂量较高（74%），对磷素固持能力低，灌溉条件下矿质态磷易随水下淋至深层土壤，导致土壤磷含量逐年降低。同时，施氮处理（NE-1/2N、NE 和 NE+1/2N）较不施氮处理提高了碱性磷酸酶活性，这表明施氮下导致的土壤磷素限制促进有机磷向矿质有效磷的转化。这与前人的研究结果一致[19-20]，表明增施氮肥可促进作物生长及对磷素的吸收和对有机磷的矿化，从而降低了土壤有效磷含量。
3.2 氮肥用量对土壤磷转化的影响
土壤有机磷矿化是指土壤中有机态磷化物在磷酸酶的作用下逐步降解，最终释放出无机态有效磷的过程，能反映土壤供磷潜力，是磷循环的重要环节[21]。土壤有效磷减少时，导致土壤氮磷比升高，可引起微生物生长的磷限制，土壤微生物的磷限制将刺激土壤细菌产生碱性磷酸酶，促进土壤有机磷的矿化和消耗。本研究中，土壤有机磷和全磷在各处理和土层中表现出相似性，与不施氮处理相比，施氮处理的有机磷含量稍低。这表明氮添加促进了马铃薯生长和磷吸收，导致土壤有效磷减少的同时，促进了土壤有机磷向有效磷的转化以弥补土壤有效磷的不足[22]。由于土壤总磷和有机磷库的含量远高于有效磷，故不同施氮处理对土壤总磷含量影响小于有效磷；但本研究结果表明，长期施氮显著提高了表层土壤的碱性磷酸酶活性，该结果与在全球范围内的整合分析结果一致[9]。本研究中亚表层土壤的碱性磷酸酶活性普遍高于表层土壤，是因为深层土壤较低的有效磷含量和高的微生物磷限制促使细菌分泌更多的碱性磷酸酶，以增加对有机磷的矿化。
养分的输入在调节土壤生态系统的碳氮磷化学计量比中起着至关重要的作用，而这种化学计量比又影响微生物的活性和功能[23]，所以养分输入低于或超过最优值时施肥效果均会下降。在本研究中，施氮增加了碱性磷酸酶编码基因 phoD 和 phoX 的丰度，但过量施氮会降低其丰度。碱性磷酸酶是土壤有机磷矿化的主要酶种类，pH 是决定碱性磷酸酶和磷转化微生物活性的主要因素，其对磷酸酶编码基因的作用大于土壤磷本身营养状况[24]；施用氮肥会降低土壤 pH 使土壤酸化，降低碱性磷酸酶活性和基因的表达。碱性磷酸酶编码基因的表达使土壤碱性磷酸酶活性增加，促进有机磷矿化而为土壤提供更多有效磷供植物吸收，所以施氮量未达到最优值前其与 phoD 和 phoX 的基因丰度呈正相关，此时土壤磷酸酶活性增加，更多有效磷被释放供植物吸收，但植物吸收速度高于有效磷释放速度，所以土壤有效磷含量与 phoD 和 phoX 的基因丰度呈负相关，两者形成负反馈调节机制，这与 Xu 等[25]和 Hu 等[26]的研究结果一致。但当土壤缺乏其他营养元素时，微生物生长、植物生长或关键基因表达受到抑制，土壤有效磷与碱性磷酸酶编码基因之间的负反馈调节机制会被掩盖[27]。本研究结果显示，NE 处理的碱性磷酸酶活性和 phoD、phoX 基因丰度最高，这证明了 NE 处理的优化施氮量是最有利于土壤磷素转化循环的施氮量；NE+1/2N 处理即使有较低的有效磷含量，但磷酸酶活性和关键基因丰度却低于 NE 处理，过量施氮使得负反馈调节机制消失的原因还有待进一步研究。
4 结论
在内蒙古半干旱区的马铃薯生产中，土壤总磷和有效磷均随施氮量增加而逐步降低，有机磷仅在高氮处理时显著降低，且表层土壤的磷素含量变化幅度高于亚表层土壤。优化施氮获得了最高的磷酸酶编码基因 phoD 和 phoX 丰度和碱性磷酸酶活性，但高量施氮降低了它们的丰度及活性。基于 NE 的氮肥推荐有助于土壤磷素的转化与有效磷供应。