摘要
现代农业中化肥长期不合理施用直接导致了土壤质量和农产品品质下降的问题，微生物肥料替代是解决这些难题的重要途径。试验从前期实验室保存的芽孢杆菌库中筛选出 9 株高产吲哚乙酸（IAA）的菌株，IAA 分泌量均在 83.27 mg/L 以上，其中 T26 分泌能力最强，为 189.14 mg/L。综合产 IAA 能力、产铁载体能力、抑菌特性等生物学特性，确定 4 株菌（T26、PA8、DY15 和 Ya6）开展进一步研究。菌株鉴定结果表明，T26、PA8、 DY15 初步归属于 Bacillus subtilis，Ya6 初步归属于 Bacillus velezensis。4 株菌均具有产铁载体能力，Ya6 具有较强的镰刀菌属真菌（Fusarium）拮抗能力。促生能力研究结果表明，添加高产 IAA 菌株的育苗基质显著促进了番茄、辣椒和糯玉米的苗期生长。番茄育苗试验中 T26、PA8 和 DY15 促生效果佳，番茄株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重分别较对照（添加等量蒸馏水）提高了 24.75% ～ 51.34%、36.08% ～ 43.67%、21.67% ～ 91.67%、 11.63% ～ 27.91%。4 株菌在低肥力土壤中应用促生效果优于在育苗基质中的应用，添加菌株处理的小白菜株高、茎粗、叶片数、叶面积、根长、地上部鲜重和地下部鲜重与对照处理呈显著性差异，分别为对照的 1.80 ～ 2.08、 1.38 ～ 1.70、1.50、2.80 ～ 3.69、1.12 ～ 1.72、4.18 ～ 5.85 和 4.45 ～ 6.41 倍。4 株菌均具有良好的促生应用潜力，将为开发微生物肥料提供优良的菌种资源。
Abstract
The long-term unreasonable application of chemical fertilizers in modern agriculture had directly led to the decline of soil and agricultural product quality. Microbial fertilizer substitution was an important way to solve these problems. Nine high-yielding strains of indole-3-acetic acid（IAA）were screened from the Bacillus library stored in the previous laboratory. The IAA secretion amounts of all strains are above 83.27 mg/L. Among them，T26 has the strongest secretion ability，which is 189.14 mg/L. Based on the comprehensive biological characteristics such as IAA production ability，iron carrier production ability，and antibacterial properties，four strains of bacteria（T26，PA8，DY15 and Ya6）were identified for further research. The results of molecular biological identification showed that T26，PA8，and DY15 belong to Bacillus subtilis， while Ya6 belongs to Bacillus velezensis. All four strains have the ability to produce iron carrier. Ya6 has a strong antagonistic ability against Fusarium. The research results of growth-promoting application ability showed that the seedling substrate added with high-yield IAA strains significantly promoted the seedling growth of tomatoes，peppers and glutinous corn. In tomato seedling experiment，T26，PA8 and DY15 had better growth promotion effects，and the plant height，stem diameter， fresh weight of aboveground and underground of tomato increased by 24.75%-51.34%，36.08%-43.67%，21.67%- 91.67%，11.63%-27.91%，respectively，compared with the control. The application of four strains of bacteria in low-fertility soil demonstrated superior growth-promoting effects compared to their use in seedling substrates. The plant height， stem diameter，number of leaves，leaf area，root length，above-ground fresh weight，and below-ground fresh weight of the treated pak choi plants showed significant differences compared to the control group. Specifically，these parameters were 1.80-2.08，1.38-1.70，1.50，2.80-3.69，1.12-1.72，4.18-5.85，and 4.45-6.41 times greater than those of the control， respectively. All four strains had good growth-promoting application potential，which would provide excellent strain resources for microbial fertilizer.
随着全球人口数量和自然资源短缺的日益加剧，粮食安全问题已成为各国面临的重大挑战[1]。化肥与农药作为现代农业生产的重要物质基础，在保障粮食安全和农业现代化中起到了至关重要的作用。然而，由于长期不合理施用带来了土壤肥力下降、土壤板结、面源污染等一系列严重的资源环境问题[2]。继“十三五”化肥农药减量增效行动后， “十四五”提出加快推进农业生产减肥减药进程，着力促进农业绿色发展[3]。微生物肥料作为一种新型环境友好型生物肥料，通过其中所含微生物的直接或间接促生、抑菌等作用，能够改良土壤生态环境、促进植物生长、增强植物抗病和抗逆性，从而提升作物产量，保护农业生态环境，在作物的减肥增效中发挥重要作用[4-6]。
植物促生菌是指能促进植物生长的有益细菌[7]。其发挥促生作用主要通过以下3种途径：第一种，直接通过分泌生长素（吲哚乙酸， IAA）、赤霉素、脱落酸和乙烯等生长相关激素刺激作物生长[8-10]；第二种，通过溶磷、解钾和固氮等作用释放和固定周围环境中的氮磷钾等元素[11]，增加作物营养物质；第三种，通过诱导抗性、分泌抗生素等方式保护作物免受病原物侵害，间接促进植物生长[12]。芽孢杆菌是植物促生菌重要菌种来源，可分泌丰富的代谢产物，其中包含大量酶、有机酸、酚类等物质。这些物质具有促进复杂有机物分解，增强作物营养吸收，拮抗病原微生物等作用[13]。前人关于促生菌的筛选、鉴定研究较多，但其实际应用效果数据较少。本研究从前期保存的芽孢杆菌库中筛选高产 IAA 菌株，综合其产铁载体、产蛋白酶、抑菌等能力确定其中具备促生潜力菌株开展应用研究。将高产 IAA 菌株添加至育苗基质和低肥力土壤中，通过测量作物株高、茎粗、叶绿素相对含量、地上部鲜重、地下部鲜重等生理指标，探索菌株在育苗基质和低肥力土壤场景中对作物的促生潜力。通过形态特征、生理生化试验和基于 16S rRNA 的系统发育树构建，最终初步鉴定菌株种属。高产 IAA 菌株应用效果研究将为优良生物菌剂菌种筛选提供理论依据，为促生菌剂不同场景应用提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料
高产 IAA 芽孢菌株来源于重庆市农业科学院农业资源与环境研究所农业微生物实验室；供试番茄品种为‘渝粉 109’，辣椒品种为‘川辣长香’，糯玉米品种为‘紫糯 66’，速生型小白菜品种为 ‘百丽’。
供试育苗基质以竹渣为原材料，养分特征：pH 7.1，电导率（EC）3.8 mS/cm，全氮 3.52 g/kg，全磷 2.34 g/kg，全钾 4.17 g/kg。供试低肥力土壤为丘陵山地新改造土，养分特征：pH 为 6.13，有机质 7.97 g/kg，全氮 0.055%，水解性氮 36.1 mg/kg，有效磷 5.5 mg/kg，速效钾 61 mg/kg。
1.2 高产吲哚乙酸菌株筛选
分泌 IAA 能力参考伍巧慧等[14]的方法开展，菌株培养 7 d 后检测。标准曲线用 3-吲哚乙酸标准品进行配置，将测定的样品吸光度代入到制作好的标准曲线中，计算菌液中 IAA 含量。
1.3 其他促生与抑菌特性
参照谢东等[15]的方法开展测试菌株溶磷能力测定；采用点接法进行解钾能力测定[16]；通过测定菌株在 Ashby 固体培养基上透明圈直径开展固氮能力测定[17]；利用 CAS 培养基进行产铁载体能力测定[18]，计算透明圈直径和菌株直径比值（D/d）；选用平板对峙法测定菌株拮抗尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）和茄腐镰刀菌 （Fusarium solani）能力；利用 ELISA 定量检测试剂盒（Microorganism ACCD ELISA KIT）测定菌株产 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶含量。参照 Peeters 等[19]的方法，通过结晶紫染色法对生物膜产量进行测定。
1.4 菌株鉴定
1.4.1 形态、生理生化鉴定
参考东秀珠等[20] 的方法对高产 IAA 菌株进行形态学、生理生化鉴定。形态学鉴定：在 LB 固体培养基上进行划线，37℃恒温培养 24 h 后观察菌落形态、边缘、透明度、凹凸度、是否有褶皱等。生理生化鉴定：开展接触酶、氧化酶、V-P 反应、明胶水解、淀粉水解、甘露醇水解和吲哚分泌等。
1.4.2 分子生物学鉴定
使用细菌 DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取细菌 DNA，然后利用通用引物 27F/1492R 扩增 16S rRNA 片段序列。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，送至华大基因测序公司进行基因测序。将获得的基因序列在 NCBI 数据库中进行比对分析，同时使用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树。
1.5 穴盘育苗促生效果
接种菌液制备：将活化后的菌株转接至装有 50 mL LB 液体培养基的 250 mL 三角瓶中，30℃、 180 r/min 恒温震荡培养 24 h 后，按 1% 接种比例转接至装有 250 mL LB 液体培养基的 500 mL 三角瓶中，30℃、180 r/min 恒温震荡培养 48 h 后，将菌液在 4℃、8000 r/min 条件下离心 10 min，沉淀用灭菌后的蒸馏水洗涤 3 次后重悬菌株，调节其细胞浓度为 1×108 CFU/mL，备用。
育苗促生试验：试验于重庆市农业科学院农业高科技园区温室内开展，番茄和辣椒育苗试验在 2021—2022 年春季各开展一次，共 2 次试验，糯玉米育苗试验在 2022 年春季开展。试验共设 5 个处理，对照（CK）：添加等量蒸馏水；PA8：添加 PA8 菌液；T26：添加 T26 菌液；Ya6：添加 Ya6 菌液； DY15：添加 DY15 菌液，每个处理 3 次重复，每个重复 72 株。菌液添加方法：在种植前一天将浓度为 1×108 CFU/mL 的菌液按 5% 的质量分数比例添加至灭菌育苗基质中，对照处理添加相同比例灭菌蒸馏水，混合均匀装盘备用。第二天将催芽露白后的种子种植于穴盘中，整个育苗过程不添加任何肥料。番茄和辣椒苗生长 30 d 后采集样品，每个处理采集 15 株，测定其株高、茎粗、叶绿素相对含量、地上部鲜重和地下部鲜重等生理指标。糯玉米苗生长 17 d 后采集样品，每个处理采集 15 株，测定其株高、茎粗、叶绿素相对含量、地上部鲜重、地下部鲜重等生理指标。其中叶绿素相对含量测定方法：在苗子第三片叶子（从上向下）上选取 3 个点，用手持式叶绿素测定仪 spad-502 测量并记录数据。
1.6 在低肥力土壤中的促生效果
试验于 2022 年秋冬季开展，试验处理同 1.5，每个处理 3 次重复。每个重复 9 盆。将低肥力土壤装至直径为 15 cm 的花盆中，每盆播种 3～4 颗速生型小白菜种子，待出苗后各留健壮苗 1～2 株。试验过程根部灌施菌液 3 次，分别为第 1、第 8、第 15 d，第一次灌施浓度为 1×108 CFU/mL 菌液 100 mL，第二次和第三次追施相同浓度的菌液 10 mL，兑水至 100 mL。整个生长期未施用其他肥料。21 d 后测量小白菜株高、茎粗、叶片数、叶面积、根长、叶绿素相对含量和地上鲜重等生理指标。叶面积测定方法为选取小白菜中上部面积差异较小的3片成熟叶片，利用便携式叶面积仪测量并记录数据。
1.7 数据处理
利用 Excel 2010 进行数据统计、表格和柱形图制作，利用 SPSS 20.0 对两个变量之间的差异显著性进行单因素方差分析，采用 LSD 进行不同处理间差异分析。利用 MEGA 11.0 中邻接法构建微生物系统发育进化树。
2 结果与分析
2.1 高产吲哚乙酸菌株的筛选
从前期保存的 376 株芽孢杆菌中筛选出 9 株高产 IAA 菌株，如图1所示，T26 产量最高， IAA 浓度为 189.14 mg/L，QK5 菌株产量最低，为 83.27 mg/L。T26 和 PA8 菌株 IAA 产量显著高于其他菌株。
2.2 其他促生与抑菌特性
开展解无机磷、固氮、解钾、产蛋白酶、产铁载体和抑菌等能力试验。如表1所示，所有菌株具有产铁载体能力，其中 DY15 产铁载体能力最强，D/d 为 2.20；所有菌株均能产生物膜，其 570 nm 处的吸光度（OD570）在 0.22～0.84；Ya6 具有拮抗尖孢镰刀菌和腐皮镰刀特性（图2）； PA8、DY15 和 Ya6 具有产 ACC 脱氨酶能力，PA8 的 ACC 脱氨酶比活力较高，为 2.86 U/mg；所有菌无解无机磷、固氮和解钾能力。综合以上特性，选择 T26、PA8、DY15 和 Ya6 共 4 株菌开展进一步研究。
图1菌株产吲哚乙酸能力
注：小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
表1高产吲哚乙酸菌株促生与抑菌特性
注：“+”表示有此项功能，“-”表示无此项功能。
图2Ya6 菌株抑菌能力
注：左图为 Ya6 菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用；右图为 Ya6 菌株对茄腐镰刀菌的抑制作用。
2.3 菌株鉴定
2.3.1 形态及生理生化鉴定
4 株菌在 LB 平板形态如图3所示，其中 T26、 PA8 和 DY15 菌落形态呈白色、圆形、微突起；Ya6 菌株呈白色、圆形，表面有褶皱，边缘不规则，微凸起。
生理生化鉴定结果如表2所示，4 株菌接触酶、明胶水解、淀粉水解、V-P 反应、10% NaCl、甲基红试验阳性；菌株 Ya6 氧化酶、葡萄糖阴性； 菌株 T26 柠檬酸盐利用阴性；菌株 PA8 柠檬酸盐和甘露醇阴性。
图3菌株平板划线
注：从左至右依次为 PA8、DY15、T26、Ya6。
表2生理生化特征
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
2.3.2 分子生物学鉴定
将 4 株菌 16S rRNA 基因测序片段在 NCBI 中进行 Blast 对比分析，其中 DY15、PA8 和 T26 与模式菌株 Bacillus subtilis DSM10 基因序列相似度达 99% 以上，Ya6 与模式菌株 Bacillus velezensis FZB42 基因序列相似度达 99% 以上。同时利用 MEGA7.0 软件 NJ 方法构建菌株 16S rRNA 系统发育树。如图4所示，T26、PA8、 DY15 菌株与 Bacillus subtilis 聚为一类，Ya6 菌株与 Bacillus velezensis 聚为一类。结合 4 株菌的平板形态和生化鉴定，初步将 T26、PA8、DY15 归属于 Bacillus subtilis，将 Ya6 归属于 Bacillus velezensis。
图4基于 16S rRNA 序列构建菌株系统发育树
2.4 番茄和辣椒育苗应用效果
在以竹渣为原料的育苗基质中按照质量分数 5% 的比例加入菌液后制备成促生型育苗基质。2021 和 2022 年两年番茄育苗结果（ 表3） 表明，PA8、T26 和 DY15 对番茄苗促生效果较好。以 2021 年为例，相较于对照，株高提高 24.75%～51.34%； 茎粗提高 36.08%～43.67%； 地上部鲜重提高 21.67%～91.67%； 地下部鲜重提高 11.63%～27.91%。Ya6 促生效果不明显。
表3高产吲哚乙酸菌株对番茄基质育苗的效果
注：表中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。
2021 和 2022 年两年辣椒育苗结果（表4）表明，PA8 对辣椒苗促生效果最佳。以 2021 年为例，PA8 相较于 CK，株高、茎粗、地上部鲜重和地下部鲜重分别提高 77.07%、23.50%、53.40% 和 24.00%，DY15 和 T26 次之，Ya6 最差。
2.5 糯玉米育苗应用效果
从表5中可以看出，4 株菌对糯玉米均有促生效果。PA8、T26 和 Ya6 对株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重均有较好的促生效果。其中株高影响最大，分别比对照增加了 10.01%、14.38% 和 17.66%。DY15 对糯玉米苗促生效果不明显。
表4高产吲哚乙酸菌株对辣椒基质育苗的效果
表5高产吲哚乙酸菌株对糯玉米育苗的促生效果
2.6 低肥力土壤中应用效果
以速生型小白菜为种植对象，选取低肥力土壤进行促生试验，4 株菌均表现出强促生效应。由表6可知，PA8、T26、DY15 和 Ya6 浇灌处理的小白菜株高、茎粗、叶片数、叶面积、根长、地上部鲜重和地下部鲜重与对照处理呈显著性差异，分别为对照的 1.80～2.08、1.38～1.70、1.50、 2.80～3.69、1.12～1.72、4.18～5.85、4.45～6.41 倍。其中添加 Ya6 和 PA8 菌液处理株高为对照的 2.08 和 1.97 倍。对照处理叶片为 4 片时，所有菌液处理叶片均达 6 片。
表6高产吲哚乙酸菌株对小白菜的促生效果
3 讨论
微生物是土壤生态系统中最活跃部分，参与了土壤中能量、养分循环及有机物质转化等调控过程，土壤中含量约 100 亿 CFU/g[21]。然而，随着现代集约化、规模化农业种植模式转变以及长期化肥农药的大量投入，出现了土壤微生物群落多样性降低、土传病原微生物不断累积等菌群失衡现象，进而导致了土壤板结、连作障碍等种植业难题，严重影响了现代农业的发展。微生物肥料因其绿色、安全特性，自 20 世纪 50 年代引进以来，随着产品的升级、种类的丰富，逐渐被接受和应用。近年来肥料生产企业发展迅猛，截至 2022 年 6 月，累计登记企业 3478 家，有效登记产品 9980 个，是 2017 年以前总登记量的近 3 倍多[22]，微生物肥料成为了现代农业绿色生产的重要投入品。促生菌株是其中重要的组成部分，可通过产 IAA、溶磷、产 ACC 脱氨酶、产铁载体等方式促进作物生长。
植物生长素是最早被发现、生理作用最重要的一种植物激素[23]，具有促进细胞生长、增加细胞体积、调节植物根系生长等功能[24]。本研究挑选的 4 株芽孢杆菌，具有强 IAA 分泌能力，其中 PA8 和 T26 分泌量更是达到 180 mg/L 以上，产量高于近年来报道的大部分促生菌，如 B. velezensis JB0319[25] （IAA 产量为 30.05 μg/mL）、B. badius[26]（IAA 产量为 58.9 μg/mL）、B.siamensis W-1[27]（IAA 产量为 27.7 μg/mL） 和 B. tropicus S03[28]（IAA 产量为 45.73 μg/mL）等。另外，部分菌株具有产 ACC 脱氨酶能力。ACC 脱氨酶是许多根际促生菌独有的微生物酶，它可将植物根系分泌的 ACC，即乙烯生物合成的直接前体，水解成 α-丁酮酸和氨，从而降低乙烯浓度、减轻胁迫，增加植物干物质积累，增强植物对营养物质和土壤养分的有效利用，进而促进植物根和茎的生长[29-31]。PA8、 DY15 和 Ya6 的 ACC 脱氨酶比活力分别为 2.86、 0.76 和 0.84 U/mg，这与其他促生相关报道结果相符。如李明源等[31] 共筛选到 26 株产 ACC 脱氨酶菌株，ACC 脱氨酶比活力为 0.4～5.6 U/mg，其中菌株 PM14、PM16 和 PM24 兼具 IAA 分泌能力，IAA 分泌量分别为 27.96、18.34 和 20.77 μg/ mL[32]。本研究筛选的高产 IAA 菌株均具有产铁载体能力和产生物膜能力，铁载体可增强植物对铁离子的吸收[33]，同时可作为信号分子诱导植物抗性反应[34]。生物膜形成是影响根际促生菌在植物根际成功定殖的重要因素，可帮助细菌抵御营养不足、营养过剩、高渗透压和抗生素胁迫等不良因素。
应用效果数据表明，PA8、T26 和 DY15 在植物育苗应用场景中促生效果明显，可显著促进番茄和辣椒苗的株高、茎粗、地上部鲜重和地下部鲜重。2021 年番茄育苗试验中 3 株菌添加后株高提高 24.75%～51.34%；茎粗提高 36.08%～43.67%；地上部鲜重提高 21.67%～91.67%；地下部鲜重提高 11.63%～27.91%。菌株 PA8、T26、DY15 和 Ya6 在低肥力土壤中均表现出明显促生效果，地上部鲜重为对照处理的 4.18～5.85 倍。综合以上菌株促生特性，高产 IAA 菌株促生机制可能为 IAA 直接刺激根系伸长，或产 ACC 脱氨酶降低植物体内 ACC 含量和乙烯浓度，或产铁载体增加植物稀缺性铁元素，或多种促生途径的协同，同时生物膜可帮助菌株在植物根际的成功定殖。这说明，高产 IAA 菌株 PA8、T26 和 DY15 是优良促生菌株，具有进一步开发为促生型生物菌剂或肥料的应用前景。 Ya6 菌株兼具促生和抑菌活性，在低肥力土壤中促生效果良好，可用于研制能提高退化农业土壤地力的复合微生物制剂。
4 结论
本研究筛选得到 4 株高产 IAA 菌株 T26、PA8、 DY15 和 Ya6，其 IAA 产量均大于 95 mg/L，其中 T26 和 PA8 的 IAA 产量超过 180 mg/L。PA8、DY15 和 Ya6 兼具 ACC 脱氨酶产生能力，Ya6 兼具抑菌能力。添加 T26、PA8 和 DY15 菌株的育苗基质可明显增加番茄和辣椒的株高、茎粗、地上部和地下部鲜重。4 株菌在低肥力土壤中对小白菜表现出强促生效果。T26、PA8、DY15 鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），Ya6 鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 （Bacillus velezensis）。