减施氮肥下绿肥配施生物炭对旱地土壤氧化亚氮排放的影响
doi: 10.11838/sfsc.1673-6257.24562
李冉1 ， 张愉乐1 ， 葛环宇1 ， 刘蕊2 ， 曹卫东1,3 ， 常单娜3
1. 山西农业大学资源环境学院，山西 晋中 030800
2. 甘肃农业大学农学院，干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070
3. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北方干旱半干旱耕地高效利用全国重点实验室，北京 100081
基金项目: 国家重点研发计划项目（2021YFD1700200） ； 国家绿肥产业技术体系（CARS-22） ； 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（1610132022013） ； 绿肥种质资源安全保存（192308690） ； 国家作物种质资源库绿肥分库运行服务（NCGRC-2023-19） ； 中国农业科学院科技创新工程
Effects of green manure combined with biochar under reducing nitrogen fertilizer on nitrous oxide emissions in dry land soil
LI Ran1 ， ZHANG Yu-le1 ， GE Huan-yu1 ， LIU Rui2 ， CAO Wei-dong1,3 ， CHANG Dan-na3
1. College of Resources and Environmental Sciences，Shanxi Agricultural University，Jinzhong Shanxi 030800
2. College of Agronomy，Gansu Agricultural University，State Key Laboratory of Arid Land Crop Science，Lanzhou Gansu 730070
3. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Efficient Utilization of Arable Land in China，Beijing 100081
摘要
氮肥投入、绿肥利用、添加生物炭均影响土壤氧化亚氮（N2O）排放，研究 3 种措施联合对土壤 N2O 排放的调控效应，为探索降低旱地土壤 N2O 排放提供参考。采用室内培养试验，设常规施氮（N100）、翻压绿肥减施 30% 化肥氮（N70 ＋ CV）及其分别配施田菁炭（M1）、玉米炭（M2）、油菜炭（M3）、麦秆炭（M4）共 6 个处理，研究土壤化学性状、N2O 排放量、硝化基因（AOA-amoA、AOB-amoA）和反硝化基因（nirK、narG 和 nosZ）丰度。结果表明：相比 N100 处理，减氮及添加生物炭处理的 N2O 累积排放量降低 31.2% ～ 71.6%；相比 N70+CV，M1、M2 和 M3 处理的 N2O 累积排放量分别降低 52.0%、43.5% 和 48.2%，M4 处理增加 16.6%。相比 N100 处理，N70 ＋ CV 及配施 M1、M2 和 M3 处理的可溶性有机碳（DOC）含量增加 52.5% ～ 209.1%，可溶性有机氮（DON）和硝态氮（NO3- -N）含量分别降低 97.0% ～ 99.6% 和 97.7% ～ 99.0%；N70 ＋ CV 处理的 pH 降低 0.03，4 个生物炭处理的 pH 增加 0.03 ～ 0.07。相比 N70+CV 处理，M1、M2 和 M3 处理的 DOC 含量分别增加 29.1%、26.1% 和 102.6%，M4 处理的 DOC 含量降低 22.2%，M2 和 M3 处理的铵态氮（NH4+ -N）含量分别降低 53.2% 和 44.5%，M4 处理的 DON、NH4+ -N 和 NO3- -N 含量均无显著变化，此外，4 种生物炭处理的 pH 增加 0.06 ～ 0.10。相比 N100 处理，N70 ＋ CV 处理土壤硝化基因 AOA-amoA、AOB-amoA 丰度分别增加 46.0%、 388.4%，反硝化基因 nirK、narG 和 nosZ 丰度增加 203.7% ～ 452.4%，（nirK ＋ narG）/nosZ 比值降低 25.4%；相比 N70+CV 处理，M1、M2 和 M3 处理的 AOA-amoA 丰度分别降低 33.4%、33.1% 和 57.2%，4 个生物炭处理的 AOBamoA 丰度降低 34.4% ～ 92.9%。反硝化基因表现不一致，但（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值降低 16.0% ～ 62.3%。回归及相关性分析表明，（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值与 N2O 排放以及土壤 NO3- -N 和 DON 含量呈正相关，与 DOC 含量呈负相关。综上，相比常规施氮处理，绿肥替代 30% 化肥氮处理降低了土壤 N2O 排放，配施田菁炭、玉米炭和油菜炭能进一步加强 N2O 的减排效应；其主要原因是通过调控土壤活性碳、氮含量，增强土壤反硝化过程。
Abstract
Nitrogen fertilizer application，utilization of green manure，and addition of biochar could influence soil nitrous oxide（N2O）emission，this study investigated the impact of the application of their combination on dry land soil N2O emission，providing theoretical support for exploring effective practice to control soil N2O emission．An incubation experiment was conducted，including conventional chemical nitrogen fertilizer（N100），incorporation of green manure together with 30% chemical N reduced（N70+CV）and its combinations with different kinds of biochar made from sesbania straw（M1），maize straw（M2），rape straw（M3）and wheat straw（M4），respectively． Soil chemical properties，N2O emission flux，nitrification genes（AOA-amoA，AOB-amoA）and denitrification genes（nirK，narG，and nosZ）abundances were measured．Results showed that，compared with N100 treatment，the N2O cumulative emission reduced by 31.2%-71.6% in the N70+CV and the four biochar treatments； Compared with N70+CV treatment，the N2O cumulative emission reduced by 52.0%，43.5%，and 48.2% in M1， M2，and M3 treatments，respectively，the increased by 16.6% in M4 treatment．Compared with N100 treatment， the N70+CV and M1，M2，and M3 treatments increased the content of dissolved organic carbon（DOC）by 52.5%-209.1%，while the content of dissolved organic nitrogen（DON）and nitrate nitrogen（NO3 - -N）decreased by 97.0%-99.6% and 97.7%-99.0%，respectively；The pH in N70+CV treatment reduced by 0.03 and the four biochar treatments increased by 0.03-0.07．Compared with N70+CV treatment，the DOC content in M1，M2，and M3 increased by 29.1%，26.1%，and 102.6%，respectively，while the the DOC content in M4 treatment decreased by 22.2%，the ammonium nitrogen content（NH4+ -N）in M2 and M3 reduced by 53.2% and 44.5%，respectively，treatment M4 showed no significance in DON，NH4+ -N，and NO3 - -N contents．The pH in the four biochar treatments increased by 0.06 to 0.10． Compared with N100 treatment，N70+CV treatment increased the abundances of soil nitrification genes（AOA-amoA、 AOB-amoA）by 46.0% and 388.4%，respectively，and increased the abundances of denitrification genes（nirK，narG， and nosZ）by 203.7%-452.4%，while decreased the ratio of（nirK +narG）/nosZ by 25.4%．Compared with those in N70+CV treatment，the abundance of AOA-amoA in the M1，M2，and M3 treatments was reduced by 33.4%，33.1%， and 57.2%，respectively；The abundances of AOB-amoA in the four biochar treatments reduced by 34.4% to 92.9%，the abundance of denitrification genes showed no obvious regularity，but the（nirK+narG）/nosZ ratio decreased by 16.0%- 62.3%．Correlation analysis indicated that the（nirK+narG）/nosZ ratio showed significant positive correlations with soil N2O emission，soil NO3 - -N and DON contents，but showed a negative correlation with DOC content．This suggested that the combination treatments enhanced the contribution of denitrification in reducing N2O emission by altering the contents of soil labile carbon and nitrogen content．In short，compared to conventional nitrogen fertilization，cutting 30% of chemical fertilizer nitrogen after incorporation of green manure could reduce soil N2O emission，and combined with biochar made from sesbania，maize，and rape could furtherly strengthen the N2O emission reduction ，the main reason was that it enhanced the soil denitrification process by regulating the content of labile carbon and nitrogen in the soil.
氧化亚氮（N2O） 的增温潜势是二氧化碳 （CO2）的 265 倍，对全球气候变暖有重要影响[1]。氮肥是我国农业生产中 N2O 排放的主要来源，过量施用氮肥会增加 N2O 排放风险[2]。生产中可通过减少氮肥用量、种植利用绿肥、施用有机肥等减少外源氮的投入，降低土壤无机氮含量；也可施用硝化抑制剂、脲酶抑制剂、生物炭等调控材料减少土壤中无机氮的损失，减少土壤 N2O 排放[3-4]。种植利用绿肥能够减少氮肥用量，提高氮肥利用率，改善土壤理化性状，保障作物高产稳产，是化肥减量增效的重要举措[5-6]。有研究发现种植利用绿肥会增加 N2O 的排放，原因是绿肥在腐解期间引发的有机氮矿化有增加 N2O 排放的风险，但也有研究表明，种植利用绿肥能减少 N2O 的排放或没有显著影响[7-8]，原因是绿肥生长期间吸收土壤中盈余的无机氮，翻压后替代部分氮肥，能够减少土壤 N2O 排放。因此，为了确保绿肥制度 N2O 减排效果，需配合其他减排技术降低绿肥腐解过程中 N2O 排放风险。
生物炭是高度芳香化和高稳定性的土壤改良剂，可通过吸附或者增加微生物对氮的固定，减少土壤中无机氮的浓度，降低 N2O排放[9-10]。Meta 分析表明，生物质炭具有降低土壤 N2O 排放的潜力，平均降幅为 54%[11]。不同原料制备的生物炭理化性质不同，施用后对土壤 N2O 排放的影响可能不同[12-13]。施用秸秆生物炭土壤 N2O 排放降低 19%～42%[14-15]；木质生物炭无显著影响[16]。由此可见，不同种类生物炭的理化性状不同，对 N2O 排放作用效果也存在差异。绿肥替代部分氮肥减少了氮肥的外源投入，也改变了氮的形态；绿肥腐解过程中产生的溶解性有机物与生物炭结合会改变其表面特性，影响生物炭对土壤中无机氮的吸附。绿肥替代化学氮肥的基础上，配合应用不同种类生物炭是否能达到协同减排的效果鲜有报道。
土壤 N2O 的排放主要由土壤硝化和反硝化作用共同调控[17]，绿肥及生物炭等调控材料通过影响土壤理化性质、碳氮等养分循环及参与硝化、反硝化作用的微生物，进而影响 N2O 排放。AOA-amoA 和 AOB-amoA 是编码氨单加氧酶的基因，主要参与土壤硝化作用[18]；narG、nirK 和 nosZ 分别是硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶[19]和氧化亚氮还原酶的编码基因，主要参与反硝化作用[20]。测定这些基因的丰度，能够表征硝化和反硝化强度与 N2O 排放之间的关系[21]。箭筈豌豆等豆科绿肥作物在我国西北地区可与小麦套种、复种或与玉米间作，减施氮肥 15%～30% 条件下，能够保证后茬作物稳产增产[22]。目前，有关绿肥替代化学氮肥配合生物炭如何通过影响土壤性质和微生物丰度调控土壤 N2O 排放亟待研究，筛选能够强化绿肥降低 N2O 排放效应的生物炭种类值得探索。与化肥氮相比，绿肥氮释放无机氮的速率较慢，绿肥替代化肥氮后，降低了土壤中无机氮的浓度[7]。同时，添加生物炭通过吸附和固定绿肥腐解产生的无机氮，进一步降低无机氮的浓度。因此，理论上绿肥替代化肥氮配合生物炭能进一步降低土壤 N2O 排放。本研究通过室内土壤培养试验，利用绿肥（箭筈豌豆）替代 30% 化肥氮，选用生产中常见的 4 类生物炭，测定 N2O 排放、土壤基本化学性状、硝化及反硝化基因丰度，分析绿肥替代氮肥及其配施生物炭对 N2O 排放的影响。研究结果为西北地区麦后复种绿肥或者玉米间作绿肥制度中利用绿肥替代氮肥及其配施生物炭降低旱地土壤 N2O 排放提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤为河西走廊地区甘肃省农业科学院 （37°43′N，102°35′E）武威绿洲农业试验基地旱地玉米田耕层（0～20 cm）土壤，土壤类型为灌漠土。土壤样品采集过 2 mm 筛后放至 4℃ 冰箱保存，用于测定基础理化性质和培养试验。土壤基本理化性质：pH 8.55，有机碳 10.1 g·kg-1，全氮 1.1 g·kg-1，有效磷 18.3 mg·kg-1，速效钾 144 mg·kg-1，无机氮 10.1 mg·kg-1。采集地上部的箭筈豌豆鲜样，经过 105℃杀青、70℃烘干、粉碎、过筛（<1 mm）后备用。箭筈豌豆的有机碳含量为 374.2 g·kg-1、全氮含量为 20.4 g·kg-1，碳氮比为 18。 4 种生物炭的 pH、碳含量、氮含量、碳氮比见表1。
表1生物炭的 pH、碳含量、氮含量、碳氮比
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
1.2 试验设计
采用室内培养试验，设常规施氮（N100），绿肥替代 30% 化肥氮（N70 ＋ CV）、绿肥替代 30% 化肥氮分别配施田菁炭（M1）、玉米炭（M2）、油菜炭（M3） 和麦秆炭（M4），共 6 个处理。将田菁地上部秸秆在 680℃ 下炭化 20 min 制得田菁炭（M1）； 将玉米地上部秸秆在 500℃ 下炭化 25 min 制得玉米炭（M2）； 将油菜地上部的秸秆在 600℃下炭化 20 min 制得油菜炭（M3）；将小麦地上部的秸秆在 800℃下炭化 20 min 制得麦秆炭（M4），4 种生物炭粒径均为 0.25 mm。氮肥、绿肥干重、生物炭添加量为田间用量的 2 倍，田间氮肥、绿肥干重、生物炭的用量分别为 360 kg·hm-2、3 t·hm-2、6 t·hm-2。培养试验中，每瓶装相当于干土 30 g 的鲜土，尿素、箭筈豌豆和生物炭添加量分别为 20.9、 40 和 80 mg·瓶-1。混匀后装入 100 mL 培养瓶，透气（不透水）膜封口，调节土壤含水量至田间持水量的 60%，每处理 4 个重复，共 24 瓶。置于 25℃ 的恒温培养箱中黑暗培养 26 d，采用称重法补充水分，每 2 d 一次，并在培养的第 1、5、10、16、 26 d 采集气体样品，气体采集时间固定在当天的 14：00—17：00；在第 26 d 采集土壤样品。
1.3 土壤化学性质测定
取培养 26 d 的土壤样品，部分土壤样品存于-80℃ 冰箱用于测定硝化、反硝化功能基因丰度，部分存于 4℃冰箱用于测定活性碳、氮含量，剩余土样风干后测定 pH。土壤理化性质测定参照鲍士旦[23]的方法。土壤 pH 采用电位法测定；土壤无机氮（硝态氮 NO3--N 和铵态氮 NH4+-N）采用 2 mol·L-1 KCl 溶液浸提，流动分析仪（SEAI AutoAnalyzer3，德国）测定；土壤可溶性有机碳 （DOC）和可溶性总氮采用超纯水浸提（水土比 2∶1，4℃、200 r·min-1 下振荡 2 h，4℃、12000 r·min-1 离心 15 min，上清液过 0.45 μm 滤膜），浸提液用 TOC/N 仪（Multi N/C2100，德国）测定，可溶性有机氮（DON）为可溶性总氮减去无机氮[24]。
1.4 温室气体采集及测定
气体采集后用带有电子捕获检测器的气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）测定 N2O 的浓度。气相色谱仪在每次测试时使用国家标准计量中心的气体进行标定。N2O 的排放通量公式[25]：
F=P×V×M×273×100022.4×m×t×(273+T)
(1)
式中，F 为 N2O 排放通量（μg·kg-1·h-1）；P 代表室温下气相色谱法检测的样品气体浓度（×10-6 mol·mol-1），V 为培养瓶内气体所占的体积（L）， M 为 N2O 摩尔质量（g·mol-1），t 为培养时间 （d）；m 为土壤样品干重（g），T 为培养温度（℃）。
N2O 累积排放量计算公式：
(2)
式中，Ct ′ 和 Ct 分别为 t′ 和 t 时 N2O累积排放量 （μg·kg-1），Ft ′ 和 Ft 分别为 t′ 和 t 时 N2O排放通量（μg·kg-1·h-1），t 和 t′ 分别为取样时间和 t 之后一次取样时间（h）。
1.5 土壤总 DNA 提取和实时荧光定量 PCR 测定
土样采用 FastDNA® Spin Kit for Soil（MP Biomedicals） 试剂盒，土壤微生物 DNA 按照说明书提取。测定土壤总 DNA 浓度和纯度采用 NanoDrop® ND-2000 微量紫外分光光度计，提取之后存于-20℃冰箱中备用。
硝化功能基因（AOA-amoA 和 AOB-amoA）丰度和反硝化功能基因（narG、nirK 和 nosZ）丰度采用实时荧光定量 PCR 仪（ThermoFisher，USA），相关引物和反应条件见表2。qPCR 扩增反应体系为：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物各 0.2 μL（20 μmol·L-1），DNA 模板 0.5 μL，补充灭菌双蒸水至 10 μL，以含有目的基因的质粒连续 10 倍稀释作为 qPCR 标准品，各方法的扩增效率为 90%～110%，标准曲线线性关系良好（R2 >0.99）。通过熔解曲线分析验证 qPCR 扩增的质量，非特异性扩增可忽略不计。
表2实时荧光定量 PCR 引物和反应条件
1.6 数据处理
使用 Excel 2021 分析处理试验数据，SPSS 22.0 进行方差分析，LSD 法进行显著性检验（P<0.05）， Origin 2021 进行作图。
2 结果与分析
2.1 土壤 N2O 排放通量与累积排放量
各处理 N2O 排放通量的趋势均呈现“快速升高—迅速降低—逐渐稳定”（图1）。常规施氮处理下 N2O 排放通量在第 5 d 达到排放高峰，其他处理在第 10 d 达到峰值，之后逐渐下降，20 d 以后趋于稳定。双因素方差分析结果表明，绿肥替代化肥氮和添加生物炭均显著影响 N2O 累积排放量。常规施氮（N100）、绿肥替代 30% 化肥氮（N70 ＋ CV）、绿肥替代 30% 化肥氮分别配施田菁炭（M1）、玉米炭（M2）、油菜炭（M3）和麦秆炭（M4）处理 N2O 累积排放量分别为 16540、9767、4692、5518、 5057 和 11385 μg·kg-1。相比 N100 处理，N70 ＋ CV 及其分别配施 M1、M3、M3 和 M4 处理 N2O 的累积排放量分别显著降低 41.0%、71.6%、66.7%、 69.4% 和 31.2%。相比 N70 ＋ CV 处理，N70 ＋ CV 配施 M1、M2 和 M3 处理 N2O 的累积排放量分别降低 52.0%、43.5% 和 48.2%，而配施 M4 处理增加 16.6%。以上结果说明，相比常规施氮，绿肥替代 30% 化肥氮及其配合生物炭均降低土壤 N2O 排放，除麦秆炭外，其他 3 种生物炭均表现出与绿肥的协同作用。
图1不同处理 N2O 的排放通量和累积排放量
注：柱上不同字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。G 为绿肥添加，M 为生物炭种类；* 为 P<0.05，** 为 P<0.01。下同。
2.2 土壤化学性状
双因素方差分析结果表明，翻压绿肥和添加生物炭均显著影响土壤 DOC、DON、NH4+-N 含量和 pH，翻压绿肥对土壤 NO3--N 含量有显著影响（表3）。培养 26 d 时，相比 N100 处理，N70 ＋ CV 处理土壤 pH 显著降低 0.03，N70 ＋ CV 配施 M1、 M2、M3 和 M4 处理土壤 pH 分别显著增加 0.03、 0.06、0.07 和 0.03；N70 ＋ CV 处理土壤 DOC 显著增加 52.5%，N70 ＋ CV 配施 M1、M2 和 M3 处理土壤 DOC 含量分别显著增加 96.8%、92.3% 和 209.1%；N70 ＋ CV 及其配施 M1、M2、M3 和 M4 处理 DON 含量分别显著降低 99.6% 及 99.7%、 99.6%、97.0% 和 99.3%；N70 ＋ CV 及其配施 M1 和 M4 处理 NH4+-N 含量分别显著增加 46.9% 及 29.4% 和 33.2%，N70 ＋ CV 配施 M2 和 M3 处理 NH4+-N 分别显著降低 31.3% 和 18.5%；N70 ＋ CV 及其配施 M1、M2、M3 和 M4 处理 NO3--N 含量分别显著降低 97.8% 及 97.8%、98.3%、99.0% 和 97.7%。
同时，相比 N70 ＋ CV 处理，N70 ＋ CV 配施 M1、M2、M3 和 M4 处理土壤 pH 分别显著增加 0.06、 0.09、0.10 和 0.06；N70 ＋ CV 配施 M1、M2 和 M3 处理土壤 DOC 含量分别显著增加 29.1%、26.1% 和 102.7%，配施 M4 处理土壤 DOC 含量显著降低 22.2%；N70 ＋ CV 配施 M2 和 M3 处理的土壤 NH4+-N 含量分别显著降低 53.2% 和 44.5%（表3）。以上结果说明，与常规施氮相比，绿肥替代 30% 化肥氮及其配施 4 种生物炭均能降低 DON 和 NO3--N 含量，从而减少 N2O 排放。
2.3 土壤硝化和反硝化功能基因丰度
双因素方差分析结果表明，翻压绿肥和添加生物炭均显著影响 AOA-amoA、AOB-amoA、 nirK、narG 和 nosZ 的基因丰度与（nirK ＋ narG）/ nosZ 的比值（图2）。相比 N100 处理，N70 ＋ CV 处理土壤 AOA-amoA、AOB-amoA、nirK、narG、 nosZ 的基因丰度分别增加 46.0%、388.4%、310.9%、 203.7% 和 452.4%，但（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值降低 25.4%。相比 N70 ＋ CV，N70 ＋ CV 配施 M1、M2 和 M3 处理 AOA-amoA 的基因丰度分别显著降低 33.4%、33.1% 和 57.2%，nirK 基因丰度分别降低 66.1%、36.6% 和 75.4%；N70 ＋ CV 配施 M1、M2、M3 和 M4 处理 AOB-amoA 的基因丰度分别降低 92.9%、46.5%、71.5% 和 34.4%， narG 基因丰度分别降低 58.2%、43.4%、64.1% 和 16.7%；N70 ＋ CV 配施 M1 和 M3 处理 nosZ 的基因丰度分别降低 33.2% 和 57.6%，N70 ＋ CV 配施 M2 和 M4 处理 nosZ 的基因丰度分别增加 69.4% 和 43.3%；N70 ＋ CV 配施 M1、M2、M3 和 M4 处理（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值分别降低 49.1%、 62.3%、41.6% 和 16.0%（图2）。以上结果说明，与常规施氮相比，绿肥替代 30% 化肥氮增加了 AOA-amoA、AOB-amoA、nirK、narG 和 nosZ 的基因丰度，但降低了（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值；绿肥替代 30% 化肥氮基础上配合生物炭降低了 AOA-amoA（M4 除外）、AOB-amoA、nirK （M4 除外）和 narG 的基因丰度及（nirK ＋ narG） /nosZ 的比值，从而减少 N2O 的排放。
表3培养 26 d 后各处理土壤化学性质
注：同列不同字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。G 为绿肥添加，M 为生物炭种类；* 为 P<0.05，** 为 P<0.01。
图2培养 26 d 后土壤硝化和反硝化微生物功能基因丰度
2.4 硝化、反硝化基因对 N2O 排放的贡献及其与土壤化学性状的相关性
回归分析结果表明，土壤化学性状中土壤 DOC 含量与土壤 N2O 排放存在显著负相关，土壤 DON 和 NO3--N 含量与土壤 N2O 排放呈现显著正相关（图3a）；土壤硝化和反硝化基因丰度与土壤 N2O 排放无显著相关性，但反硝化基因（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值与土壤 N2O 排放存在显著正相关（图3b）。对硝化和反硝化基因与土壤化学性状的相关性分析发现，参与硝化作用的 AOA-amoA 和 AOB-amoA 基因与土壤 NO3--N、DON 含量无显著相关性，反硝化作用的 nirK、narG 和 nosZ 基因与土壤 NO3--N、 DON 含量呈现显著负相关。（nirK ＋ narG）/nosZ 比值与土壤 NO3--N、DON 含量呈现显著正相关，与 DOC 含量呈显著负相关。以上结果说明，绿肥替代化肥氮及其配施生物炭主要通过影响调控反硝化作用，降低土壤 NO3--N 和 DON 含量，增加土壤 DOC 浓度，减少土壤 N2O 排放（图3c）。
图3土壤化学性状（a）、硝化、反硝化基因丰度对土壤 N2O 排放的影响（b）及其与土壤基本化学性状间相关性（c）
注：DOC、DON、NH4+-N、NO3--N 分别为可溶性有机碳、可溶性有机氮、铵态氮、硝态氮。
3 讨论
3.1 土壤化学性状对 N2O 排放的影响
本研究中，相比常规施氮处理，绿肥替代 30% 化肥氮及其配施 4 种生物炭处理下，土壤 N2O 排放高峰均从第 5 d 延迟到第 10 d，主要是与尿素相比绿肥腐解从有机氮转化为无机氮的时间较长。与绿肥替代 30% 化肥氮相比，除麦秆炭外，配合其他 3 种生物炭处理均显著降低了第 10 d 的排放峰值 （图1）。同时，与常规施氮相比，绿肥替代 30% 化肥氮及其配合生物炭均显著降低了土壤 N2O 累积排放量。主要原因是虽然绿肥腐解过程中也会产生一定量的无机氮，但绿肥的 N2O 的排放系数较低，理论上等氮含量的绿肥排放 N2O 更少[31]，且生物炭能吸附绿肥腐解过程中释放的无机氮，进一步降低 N2O 底物的浓度[32]。配合不同生物炭减排的效果存在差异，田菁炭、玉米炭和油菜炭表现出协同降低 N2O 排放，而麦秆炭则增加了 N2O 排放。回归分析显示 N2O 排放与 NO3--N 和 DON 含量显著正相关，与 DOC 含量呈显著负相关（图3）。 NO3--N 是硝化和反硝化的底物，土壤 DON 易与其转化，影响 NO3--N 浓度[33]。绿肥替代 30% 化肥氮显著降低了土壤 NO3--N 和 DON 浓度，可能是因为绿肥未完全腐解，绿肥处理中大量氮素以有机氮的形式存在于绿肥残体中，配施田菁炭、玉米炭和油菜炭对土壤 NO3--N 含量有降低的趋势，而配施麦秆炭对土壤 NO3--N 含量有增加的趋势 （表3）。土壤 DOC 会影响反硝化的微生物群落结构和氮氧化物还原酶的活性[34]。与绿肥替代 30% 化肥氮相比，田菁炭、玉米炭和油菜炭显著增加了土壤 DOC 含量，而麦秆炭显著降低了土壤 DOC 含量（表3）。说明绿肥替代 30% 化肥氮通过降低 NO3--N 含量减少土壤 N2O 排放，配合配施田菁炭、玉米炭和油菜炭可能通过降低土壤 NO3--N 含量和增加 DOC 含量降低土壤 N2O 排放，而麦秆炭通过增加土壤 NO3--N 含量和降低 DOC 含量增加土壤 N2O 排放。
3.2 土壤硝化和反硝化功能基因丰度对 N2O 排放的影响
硝化和反硝化过程均会产生 N2O，其对 N2O 排放的影响受到硝化和反硝化功能基因的调控[35]。一般施用氮肥会增加硝化、反硝化基因丰度，进而增加 N2O 的排放[36]。本研究中，绿肥替代 30% 化肥氮及其配施生物炭虽然增加了硝化和反硝化基因的丰度，但降低（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值 （图3）。nirK 和 narG 基因主要参与反硝化生成 N2O 的过程，nosZ 基因主要参与反硝化 N2O 还原为 N2 的过程，（nirK ＋ narG）/nosZ 比值降低会提高 N2O 转化为 N2 的比例，进而降低 N2O 排放[37]。回归分析表明土壤硝化和反硝化基因与土壤 N2O 排放并无显著相关性，但反硝化基因（nirK ＋ narG）/nosZ 的比值与土壤 N2O 排放间呈现显著正相关。本研究结果也反映了反硝化作用对 N2O 产生起主导作用 （图3b），Peng 等[38]的研究同样表明旱地生态系统中，N2O 的排放量主要受到反硝化微生物活动的调节。相关性结果表明绿肥替代 30% 氮肥及其配施生物炭通过调控土壤 DOC、DON 和 NO3--N 含量，降低（nirK ＋ narG）/nosZ，进而减少N2O 排放。说明土壤 N2O 排放受底物浓度和微生物的双重影响。因此，田菁炭、玉米炭和油菜炭可作为与绿肥协同减排的材料。本研究是控制条件下的培养试验，绿肥替代 30% 化肥氮及其配施生物炭减排土壤 N2O 的潜力仍需要通过田间试验进一步验证。
4 结论
相比于常规施氮处理，绿肥替代 30% 化肥氮处理降低了 N2O 排放，配施田菁炭、玉米炭和油菜炭能强化绿肥减排 N2O 效应。减排的主要原因是通过降低土壤 NO3--N 和 DON 含量，增加 DOC 含量，降低调控反硝化作用基因（nirK ＋ narG）/ nosZ，提高反硝化完成度，减少 N2O 排放。综合考虑减少土壤 N2O 排放，田菁炭、玉米炭和油菜炭可作为与绿肥协同减排的材料。
图1不同处理 N2O 的排放通量和累积排放量
图2培养 26 d 后土壤硝化和反硝化微生物功能基因丰度
图3土壤化学性状（a）、硝化、反硝化基因丰度对土壤 N2O 排放的影响（b）及其与土壤基本化学性状间相关性（c）
表1生物炭的 pH、碳含量、氮含量、碳氮比
表2实时荧光定量 PCR 引物和反应条件
表3培养 26 d 后各处理土壤化学性质
张玉铭, 胡春胜, 张佳宝, 等. 农田土壤主要温室气体(CO2、CH4、N2O)的源/汇强度及其温室效应研究进展[J]. 中国生态农业学报,2011,19(4):966-975.
Peng S Z, Yang S H, Xu J Z,et al. Nitrogen and phosphorus leaching losses from paddy fields with different water and nitrogen managements[J]. Paddy and Water Environment,2011,9:333-342.
李玥, 巨晓棠. 农田氧化亚氮减排的关键是合理施氮[J]. 农业环境科学学报,2020,39(4):842-851.
Cui X Q, Shang Z Y, Xia L L,et al. Deceleration of croplandN2O emissions in China and future mitigation potentials[J]. Environmental Science & Technology,2022,56(7):4665-4675.
曹卫东, 包兴国, 徐昌旭, 等. 中国绿肥科研60年回顾与未来展望[J]. 植物营养与肥料学报,2017,23(6):1450-1461.
曹卫东, 黄鸿翔. 关于我国恢复和发展绿肥若干问题的思考[J]. 中国土壤与肥料,2009(4):1-3.
Abdalla M, Hastings A, Cheng K,et al. A critical review of the impacts of cover crops on nitrogen leaching,net greenhouse gas balance and crop productivity[J]. Global Change Biology,2019,25(8):2530-2543.
Lal R, Wang Y, Ma Y,et al. Soil carbon sequestration impacts on global climate change and food security[J]. Science,2004,304:1623-1627.
Major J, Rondon M, Molina D,et al. Maize yield and nutrition during 4 years after biochar application to a Colombian savanna oxisol[J]. Plant and Soil,2010,333(1-2):117-128.
刘淼, 王志春, 杨福, 等. 生物炭在盐碱地改良中的应用进展[J]. 水土保持学报,2021,35(3):1-8.
Cayuela M L,van Zwieten L, Singh B P,et al. Biochar’s role in mitigating soil nitrous oxide emissions:a review and meta-analysis[J]. Agriculture, Ecosystems & Environment,2014,191:5-16.
Prommer J, Wanek W, Hofhansl F,et al. Biochar decelerates soil organic nitrogen cycling but stimulates soil nitrification in a temperate arable field trial[J]. Plos One,2014,9(1):e86388.
赖倩倩, 杨霖, 秦兴华, 等. 蔗渣生物质炭对喀斯特农田石灰性土壤氮转化过程的短期影响[J]. 中国岩溶,2019,38(3):450-457.
刘丽君, 朱启林, 李凯凯, 等. 添加生物炭对海南燥红壤 N2O 和 CO2 排放的影响[J]. 农业环境科学学报,2021,40(9):2049-2056.
Li X, Ma J, Yao Y,et al. Methane and nitrous oxide emissions from irrigated lowland rice paddies after wheat straw application and midseason aeration[J]. Nutrient Cycling in Agroecosystems,2014,100(1):65-76.
Clough T J, Bertram J E, Raya J L,et al. Unweathered wood biochar impact on nitrous oxide emissions from a bovine-urineamended pasture soil[J]. Soil Science Society of America Journal,2010,74:852-860.
IPCC. Climate change 2013:the physical science basis[M]. New York: Cambridge University Press,2013.
Brochier-Armanet C, Boussau B, Gribaldo S,et al. Mesophilic crenarchaeota:proposal for a third archaeal phylum,the Thaumarchaeota[J]. Nature Reviews Microbiology,2008,6(3):245-252.
Bakken L R, Bergaust L, Liu B,et al. Regulation of denitrification at the cellular level:a clue to the understanding of N2O emissions from soils[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences,2012,367:1226-1234.
Zumft W G. Cell biology and molecular basis of denitrification[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997,61(4):533-616.
高嵩涓, 曹卫东, 白金顺, 等. 湘南红壤稻田 AOA-amoA、narG、nosZ 基因丰度及其环境影响因子[J]. 中国土壤与肥料,2017(1):21-27.
张文霞, 李盼, 殷文, 等. 麦后复种绿肥及配施不同水平氮肥对小麦产量、品质及氮素利用的影响[J]. 中国农业科学,2023,56(17):3317-3330.
鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 北京: 中国农业出版社,2007.
Zhou G, Cao W, Bai J,et al. Non-additive responses of soil C and N to rice straw and hairy vetch(Vicia villosa Roth L.)mixtures in a paddy soil[J]. Plant and Soil,2019,436(1-2):229-244.
Chang D, Liu C, Li B,et al. Effects of incorporating Chinese milk vetch on reductive material characteristics and greenhouse gas emissions in paddy soil[J]. Soil and Tillage Research,2018,27(12):133-144.
Park S J, Park B J, Rhee S K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments[J]. Extremophiles,2008,12(4):605-615.
Rotthauwe J H, Witzel K P, Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker:molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997,63(12):4704-4712.
Hallin S, Lindgred P E. PCR Detection of genes encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(4):1652-1657.
Philippot L, Piutti S, Martin-Laurent F,et al. Molecular analysis of the nitrate-reducing community from unplanted and maize-planted soils[J]. Applied and Environmental Microbiology,2002,68(12):6121-6128.
Henry S, Bru D, Stres B,et al. Quantitative detection of the nosZ gene,encoding nitrous oxide reductase,and comparison of the abundances of 16S rRNA,narG,nirK,and nosZ genes in soils[J]. Applied and Environmental Microbiology,2006,72(8):5181-5189.
Sant′ Anna S A C, Martins M R, Goulart J M,et al. Biological nitrogen fixation and soil N2O emissions from legume residues in an acrisol in SE Brazil[J]. Geoderma Regional,2018,15:e196.
Liu S X, Hao Y J, Wang H,et al. Bidirectional potential effects of DON transformation in vadose zones on groundwater nitrate contamination:different contributions to nitrification and denitrification[J]. Journal of Hazardous Materials,2023,448:130976.
Kameyama K, Miyamoto T, Shiono T,et al. Influence of sugarcane bagasse-derived biochar application on nitrate leaching in calcaric dark red soil[J]. Special Section: Environmental Benefit of Biochar,2012,41(4):1131-1137.
Liu S X, Hao Y J, Wang H,et al. Bidirectional potential effects of DON transformation in vadose zones on groundwater nitrate contamination:different contributions to nitrification and denitrification[J]. Journal of Hazardous Materials,2023,448:130976.
朱永官, 王晓辉, 杨小茹, 等. 农田土壤 N2O 产生的关键微生物过程及减排措施[J]. 环境科学,2014,35(2):792-800.
董燕, 王正银. 尿素在土壤中的转化与植物利用效率[J]. 磷肥与复肥,2005(2):76-78.
Xu X Y, Liu Y W, Singh B P,et al. NosZ clade II rather than clade I determine in situ N2O emissions with different fertilizer types under simulated climate change and its legacy[J]. Soil Biology and Biochemistry,2020,150:107974.
Peng Y, Wang T, Li J,et al. Temporal-scale-dependent mechanisms of forest soil nitrous oxide emissions under nitrogen addition[J]. Communications Earth & Environment,2024,5(1):512.
总访问量：今日访问：
地址：北京海淀区中关村南大街12号中国农业科学院农业资源与农业区划研究所  邮编：100081
电话：010－82108656传真：010-82106225Email：trfl@caas.cn
©版权所有：《中国土壤与肥料》编辑部      技术支持：北京勤云科技发展有限公司
紧急通知：《中国土壤与肥料》编辑部没有给作者发“稿件深度复核邀请”的邮件，也没有“优秀论文深度复核计划”，请收到类似邮件的作者不要加微信，以免受骗。
关闭