摘要
为揭示烟田土壤养分和细菌群落对覆膜的响应机制，在贵州南部典型烟草种植区设置裸土栽培（CK） 和覆膜栽培（MU）处理，观测土壤理化性状和细菌群落，探讨土壤酶、细菌群落与环境因子的相关性。结果表明，覆膜栽培土壤速效钾含量在打顶期和打顶期后 30 d 均显著高于裸土栽培，增幅分别为 12.77% ～ 41.44% 和 11.75% ～ 16.33%。蔗糖酶活性在打顶期、打顶期后 30 d 和采烤结束期较裸土栽培分别下降了 9.98% ～ 26.30%、 21.44% ～ 25.74% 和 6.58% ～ 26.48%；酸性磷酸酶活性在采烤结束期提高至显著水平（P<0.05），增幅达 9.06% ～ 14.94%；覆膜栽培模式改变了土壤细菌群落结构，并降低了土壤细菌群落丰富度；覆膜栽培提升了绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteriota）的相对丰度，增幅分别为 47.85% ～ 54.00% 和 36.54% ～ 73.94%，变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度分别降低了 32.23% ～ 32.35% 和 24.10% ～ 40.68%。冗余分析结果表明，速效钾、有效磷和蔗糖酶是影响土壤细菌群落结构变化的关键因子。综上，覆膜栽培模式有利于提高黔南典型烟区土壤肥力，保证土壤养分对烤烟生长的均衡供应，并提高了烤烟根际土壤有益菌丰度占比，但会降低根际土壤细菌群落丰度。该结果对烤烟覆膜栽培在贵州南部典型烟区的应用具有较好的指导作用。
Abstract
In order to reveal the response mechanism of soil nutrients and bacterial communities in tobacco fields to mulching，bare soil cultivation（CK）and mulching（MU）treatments were set up in a typical tobacco growing area in southern Guizhou，to observe soil physicochemical properties and bacterial communities，and to explore the correlation between soil enzymes，bacterial communities and environmental factors. The results showed that the soil available potassium content of mulching cultivation was significantly higher than that of bare soil cultivation at the topping stage and 30 days after the topping stage，with increases ranging from 12.77%-41.44% and 11.75%-16.33%，respectively. Sucrase activity decreased by 9.98%-26.30%，21.44%-25.74% and 6.58%-26.48% at topping，30 days after topping and end of harvesting and roasting periods，respectively，compared to bare soil cultivation. Acid phosphatase activity increased significantly （P<0.05）at the end of the harvesting and roasting period，with increases ranging from 9.06%-14.94%. The mulching cultivation mode changed the soil bacterial community structure and reduced the soil bacterial community richness. Mulching cultivation enhanced the relative abundance of Chloroflexi and Acidobacteriota by 47.85%-54.00% and 36.54%-73.94%， respectively reduced Proteobacteria and Actinobacteriota by 32.23%-32.35% and 24.10%-40.68%，respectively. The results of redundancy analysis showed that available potassium，available phosphorus and sucrase were the key factors influencing the changes in soil bacterial community structure. In conclusion，the mulching cultivation mode was conducive to improving soil fertility and ensuring balanced supply of soil nutrients to the growth of roasted tobacco in typical tobacco areas in southern Guizhou，and increased the percentage of beneficial bacteria abundance in the rhizosphere soil of roasted tobacco，but decreased the abundance of soil bacterial community in the inter-root soil. This result is a good guide for the application of roasted tobacco mulching cultivation in typical tobacco areas in southern Guizhou.
烤烟是我国重要的经济作物，而健康的土壤环境是保障优质烤烟生产的基础，合理的栽培模式则是维持土壤养分平衡的关键因素[1-2]。覆膜栽培作为我国烤烟的主要栽培模式[3]，在增加土壤保湿性、提高土壤表面温度、改善土壤结构方面发挥了重要作用，从而影响土壤细菌群落和酶活性，进而影响土壤养分的转运效果[4-5]。目前，关于烤烟覆膜栽培的研究主要集中在作物产量、土壤养分、土壤酶活性及微生物数量等方面[6-7]，对于土壤细菌群落特征及其与土壤环境因子关联性的研究却较为匮乏。
土壤细菌参与了土壤有机物的分解、生物固氮和养分循环等多种生态系统过程，通过矿化作用将土壤养分转化为植物可利用的形式[8]。此外，微生物还通过分泌粘性多糖改变土壤结构，调节植物激素平衡，并帮助植物抵御病虫害[9]。根际土壤作为植物与土壤物质交换和能量流动的界面，是细菌最活跃的栖息地之一[10-11]。覆膜栽培可通过改变根际土壤环境，进而影响土壤细菌群落结构[12]。已有研究表明，覆膜栽培能够显著改善马铃薯根际土壤环境，提升土壤生物活性和养分有效性，从而促进植株生长，最终提高作物产量[13]。Jacquiod 等[14] 的研究指出，覆膜栽培条件下的细菌香农指数明显高于裸露土壤，表明细菌均匀度增加。此外，还有研究表明，在覆膜栽培模式下，薄膜残留加剧了土壤中细菌群落的重组和替换，降低了细菌种群的稳定性[15]。因此，合理评估覆膜栽培条件下烤烟根际土壤细菌群落的变化特征及其与环境因子的关联性，对改善烤烟根际土壤微环境并提高优质烤烟生产具有重要意义。
基于当前研究进展，本研究选取了贵州省黔南布依族苗族自治州平塘县甲卧村和苗坡村 2 个典型烟田试验土壤，采用高通量测序等技术，分析了裸土和覆膜栽培模式下土壤细菌群落特征，及其与土壤理化性质、酶活性的关联性。旨在揭示土壤养分和细菌群落对覆膜的响应规律，为覆膜栽培技术在黔南州烤烟生产中的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
本研究选取了贵州省黔南布依族苗族自治州（简称黔南州）平塘县平舟镇的甲卧村试验田 （黏壤土）（25°87′N、107°23′E）和苗坡村试验田 （黏土）（25°84′N、107°24′E）作为研究对象。该区域属亚热带湿润性季风气候，年均气温为 16.7℃，年均降水量为 1259 mm，年均蒸发量为 1294 mm。 2 个试验田的土壤初始理化性质如表1所示。
表1供试土壤初始理化性质
1.2 试验设计
试验正式开始于 2023 年 5 月，供试烟草品种为 ‘云烟 87’，并于 9 月完成采收。2 个试验田均设置了覆膜栽培（MU）和裸土栽培（CK）2 个处理，每个处理设置 3 次重复。裸土栽培处理采用常规起垄栽培方式。覆膜栽培处理为先起垄后覆膜，垄高为 0.25 m，覆膜后采用井窖式移栽技术进行烤烟移栽，烤烟全生育期覆膜。覆膜材料为农用聚乙烯透明薄膜，膜厚度 0.01 mm。垄间行距 1.1 m、烤烟株距 0.55 m，小区面积为 50 m2 （ 长 × 宽 =10 m×5 m），4 行区，各小区随机分布。基肥施用量为 675 kg·hm-2 （烟草专用复合肥，N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25）；移栽后 30 d 追肥 84 kg·hm-2（ 烟草专用复合肥， N∶P2O5 ∶K2O=15∶0∶30）。栽培和管理过程严格按照当地常规烤烟生产技术规范进行。
1.3 样品采集与测定
在打顶期、打顶期后 30 d 和采收结束期运用 “抖根法”采集烟株根际土壤样品，用毛刷扫下附着于根部 1～2 mm 的土壤收集于自封袋中。对土壤样品进行初步混匀后，放置在盛有干冰的保鲜箱中运输至相关实验室。开展微生物高通量测序和土壤酶活性测定；部分土壤样品置于阴凉处自然风干，用于土壤理化性质的测定。
土壤基本理化性质的测定参考《土壤农化分析》[16]：碱解氮采用碱解扩散法；有效磷采用钼锑抗比色法；速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法；pH 采用电位计法，水、土比为 5∶1；有机质采用重铬酸钾-外加热法；全氮采用半微量凯氏法；全磷采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法；全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法。土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法；蔗糖酶活性采用 3，5-二硝基水杨酸比色法[17]；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法[18]；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法[19]。
1.4 DNA 提取与扩增子测序
采用 E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek， Norcross，GA，U.S.）试剂盒，提取土壤样品中的细菌总 DNA。细菌群落 16S rRNA V3+V4 区的扩增采用引物 341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'） 和 806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）。扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测后，使用 Axyprep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences， Union City，CA，U.S.）试剂盒纯化，制备 Smrtbell 文库。将每个样本连接特定的 barcode 序列后等质量混合，扩增子混合物通过 Pacific Biosciences Smrtbell™ Template Prep kit 1.0 构建测序文库，并在 PacBio Sequel Ⅱ平台上进行测序。所有扩增子测序均由上海凌恩生物科技有限公司（上海）完成，并通过在线平台（http：//delivery.biozeron.com/projectBz）进行土壤细菌群落分析与可视化。
1.5 数据统计与分析
采用 Excel 2010 进行原始数据的整理，运用 SPSS 26.0 进行数据统计分析，采用独立样本 T 检验（P<0.05）分析土壤理化性质和酶活性的差异； 采用 R 4.0.2 中的 vegan 包进行主成分分析；采用 Canoco 5.0 进行土壤细菌群落和土壤环境因子冗余分析；采用 Python 3.8.10 进行 LEFSe 分析。
2 结果与分析
2.1 覆膜栽培模式对土壤理化性质的影响
表2结果显示，甲卧村和苗坡村两块试验田各处理间土壤 pH、有机质含量和全量养分均不存在显著性差异。覆膜栽培对土壤 pH、有机质和全量养分含量的影响较小。
表2覆膜栽培模式对土壤理化性质的影响
注：同列不同小写字母表示同一试验区不同处理间差异显著（P<0.05）。表5 同。
表3结果显示，覆膜栽培和裸土栽培土壤碱解氮含量在烤烟各生育期均无显著差异。覆膜栽培条件下土壤有效磷含量随着生育期的推进均整体呈增高趋势，但增加量明显不同。在烤烟打顶期，甲卧村覆膜栽培土壤有效磷含量较裸土栽培显著提高了 77.60%，而在打顶期后 30 d 和采烤结束期，覆膜栽培和裸土栽培土壤有效磷含量均未达到显著水平。覆膜栽培对土壤速效钾的影响较大，在打顶期和打顶期后 30 d 分别较裸土栽培显著提高了 12.77%～41.44% 和 11.75%～16.33%，而在采烤结束期，两处理间无显著差异。
总体而言，覆膜栽培模式在烤烟生长前期有效提高了土壤速效养分的含量，但在采烤结束期，覆膜栽培和裸土栽培条件下的土壤速效养分含量无显著差异。
表3覆膜栽培模式对土壤速效养分的影响
注：同列不同小写字母表示相同生育期、同一试验区不同处理间差异显著（P<0.05）。表4 同。
2.2 覆膜栽培模式对土壤酶活性的影响
覆膜和裸土栽培模式对土壤酶活性的影响如表4所示。蔗糖酶活性的变化随着生育期的推进呈现先增加后降低的趋势。覆膜栽培与裸土栽培相比，在打顶期、打顶期后 30 d 和采烤结束期均显著降低了土壤蔗糖酶的活性，降幅分别为 9.98%～26.30%、21.44%～25.74% 和 6.58%～26.48%。在打顶期和打顶期后 30 d，覆膜和裸土栽培条件下的土壤酸性磷酸酶活性均无显著性差异，但在采烤结束期覆膜栽培的土壤酸性磷酸酶活性显著提高了 9.06%～14.94%。各处理间及不同生育期的土壤脲酶和过氧化氢酶活性均无显著差异。
表4覆膜栽培模式对土壤酶活性的影响
续表
2.3 覆膜栽培模式下土壤细菌群落变化特征
基于主成分分析（PCA），分别对 2 个试验田各处理的土壤细菌群落结构进行分析，处理间的距离表明群落结构差异的大小。由图1（a，b）可知 PC1 和 PC2 对甲卧试验田土壤细菌群落组成差异的解释率分别为 89.18% 和 9.32%，对苗坡试验田细菌群落组成差异的解释率分别为 46.31% 和 21.36%。2 个试验田的覆膜栽培和裸土栽培在 PC1 轴和 PC2 轴上均可明显区分，说明覆膜对土壤细菌群落结构产生了显著影响。
Chao1 指数、ACE 指数和 Shannon 指数、Simpson 指数分别用于揭示土壤细菌的丰富度和多样性。不同处理下土壤细菌群落 Alpha 多样性指数如表5所示。在甲卧村和苗坡村 2 个试验田中，覆膜栽培的土壤细菌 Chao1 指数和 ACE 指数均低于裸土栽培。其中，甲卧村覆膜栽培的 Chao1 指数和 ACE 指数较裸土栽培分别低 32.59% 和 33.31%，差异达到显著水平（P <0.05）。2 个试验田各处理的 Shannon 指数和 Simpson 指数无显著性差异。覆膜栽培模式下，土壤细菌群落的丰富度低于裸土栽培，而细菌群落的多样性不存在显著差异。
图1覆膜栽培模式下土壤细菌群落 Beta 多样性
注：a、b 分别表示甲卧村试验田、苗坡村试验田土壤细菌群落 Beta 多样性。
表5覆膜栽培模式对土壤细菌群落 Alpha 多样性的影响
如图2所示，2 个试验田土壤细菌群落的优势菌群均为变形菌门（Proteobacteria，22.65%～33.51%）、绿弯菌门（Chloroflexi，14.57%～30.05%）、酸杆菌门（Acidobacteriota，12.72%～22.12%） 和放线菌门（Actinobacteriota，8.37%～14.11%）。覆膜栽培与裸土栽培相比，提高了绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度，增幅分别为 47.85%～54.00% 和 36.54%～73.94%，显著降低了变形菌门和放线菌门的相对丰度，降幅分别为 32.23%～32.35% 和 24.10%～40.68%。
属水平下前 10 的土壤细菌群落组成分析如图3所示。在细菌群落中，覆膜栽培显著提高了厌氧绳菌属（Anaerolinea） 和 Candidatus Koribacter 的相对丰度，增幅分别为 145.19%～251.70% 和 336.29%～436.59%，显著降低了鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和慢生根瘤菌属 （Bradyrhizobium）的相对丰度，降幅分别为 145.19%～251.70%、145.19%～251.70% 和 336.29%～436.59%。
图2覆膜栽培模式门水平下土壤细菌群落组成
注：a、b 分别表示甲卧村试验田、苗坡村试验田土壤细菌群组成。图3 同。
图3覆膜栽培模式属水平下土壤细菌群落组成
利用 LEFSe 多层次物种差异分析了覆膜和裸土栽培的土壤细菌群落优势菌群组成及相对丰度， LDA 阈值为 2。在甲卧试验田的土壤细菌群落中，覆膜栽培显著富集了酸杆菌科（Acidobacteriae），裸土栽培显著富集了放线菌门（图4a）。在苗坡试验田中，覆膜栽培显著富集了绿弯菌门，裸土栽培同样显著富集了放线菌门（图4b）。
综上，覆膜栽培显著改变了烤烟土壤细菌群落结构。其中，覆膜栽培总体降低了土壤细菌群落丰度，但优势菌群的相对丰度明显增加，而群落多样性变化无显著差异。覆膜栽培提高了绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度，但降低了放线菌门和变形菌门的相对丰度，其变化均达到显著水平。
2.4 细菌群落与土壤环境因子关联性分析
采用冗余分析方法对土壤环境因子和细菌群落进行相关性分析。甲卧村土壤速效养分、全量养分、酶活性和细菌群落结构的冗余分析显示，轴 1 和轴 2 共分别解释总变异的 93.93%、83.58% 和 83.58%，其中土壤有效磷（AP，R2 =0.9287， P=0.014） 和速效钾（AK，R2 =0.9685，P=0.033）显著影响了细菌群落结构（ 图5a，b，c）。苗坡村土壤速效养分、全量养分、酶活性与细菌群落结构的冗余分析总解释率分别为 84.73%、 63.09%、63.09%。细菌群落结构与土壤蔗糖酶 （SC12，R2 =0.9038，P=0.033）呈显著相关性 （图5d，e，f）。覆膜栽培模式下，有效磷、速效钾和蔗糖酶是影响土壤细菌群落结构变化的关键因子。
图4土壤细菌群落多层次物种差异分析
注：a、b 分别表示甲卧村试验田、苗坡村试验田土壤细菌群落多层次物种差异分析。
图5土壤细菌群落与土壤环境因子冗余分析
注：图5 表示甲卧村试验田（a、b、c）和苗坡村试验田（d、e、f）土壤细菌群落分别与土壤速效养分、全量养分和酶活性冗余分析；SOM：有机质， TN：全氮，TP：全磷，TK：全钾，AN：碱解氮，AP：有效磷，AK：速效钾，UE：脲酶，SC12：蔗糖酶，CAT：过氧化氢酶，ACP：酸性磷酸酶。
3 讨论
土壤速效养分含量和酶活性是衡量烤烟土壤养分供应的重要指标。土壤养分的变化影响细菌群落结构，并进一步促进土壤酶活性的变化，土壤环境因子与细菌群落呈复杂且多变的网络性关系。覆膜栽培作为黔南典型烟区的重要增产手段，地膜覆盖后，抑制了土壤和大气的水热交换，改善了膜下水热循环，减少了土壤蒸发，能有效提高土壤温度和含水量，降低养分淋溶损失[20]。本研究系统分析了覆膜栽培对土壤养分、酶活性及细菌群落结构的影响，表明覆膜栽培可通过调节土壤微环境对烤烟生长的促进作用。
研究发现，覆膜栽培能够有效提高土壤速效钾含量，但对碱解氮、有效磷的影响相对较小。烤烟作为典型喜钾植物，对钾素需求量较大，通常钾肥施用量也较高。在打顶期和打顶期后 30 d，覆膜处理的速效钾含量较裸土栽培分别增加了 12.77%～41.44% 和 11.75%～16.33%。这一效果得益于覆膜栽培减少了降雨引起的肥料的径流和淋溶损失，从而维持土壤肥力，满足了烤烟生长前期的养分需求[21]。采烤结束时，土壤速效钾含量在不同栽培模式下差异不显著，这可能与后期速效钾已被烤烟充分吸收有关。烤烟钾含量是判断烟叶质量的重要标准，覆膜栽培的增产效应与烤烟对钾的高需求密切相关[22]。
覆膜栽培还对土壤酶活性产生了显著影响，特别是显著提高了酸性磷酸酶活性，同时降低了蔗糖酶活性。微生物胞外产物和植物根际分泌物是土壤酶活性的主要来源。在烤烟栽培打顶期至打顶期后 30 d，黔南州气温较高，覆膜在该时期对土壤具有进一步的增温效果。酸性磷酸酶在调控植物磷营养方面有着十分重要的作用，其活性直接影响着有机磷有效性的高低。有研究表明，覆膜栽培良好的保温、保墒作用能有效地提高作物地上部分的磷素吸收量，导致土壤中的有效磷含量下降，植物根系和土壤微生物就会分泌大量酸性磷酸酶，加速水解土壤中高活性有机磷以供植物生长[23-24]。蔗糖酶活性与土壤通气状况密切相关，地膜覆盖后很大程度上阻挡了氧气流通，当氧气含量消耗量达到蔗糖酶的临界阈值时，蔗糖酶的活性会受到抑制[25-26]。
覆膜栽培对土壤细菌群落结构的影响十分显著，改变了细菌群落的 Alpha 多样性指数，细菌群落丰度显著低于裸土栽培。这与覆膜条件下土壤温度较高、空气流通性差和氧气不足有关，且覆膜有可能通过减少了作物凋落物的输入，在一定程度上削弱了细菌的有机物来源[27]。2 种栽培模式下的优势菌门包括绿弯菌门、酸杆菌门、变形菌门和放线菌门。覆膜栽培提高了绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度，但显著抑制了变形菌门和放线菌门的增长，使得微生物群落丰度整体呈现降低趋势。绿弯菌和酸杆菌均属于兼性厌氧型细菌，绿弯菌门在碳、氮、硫等元素的生物地球化学循环中发挥重要作用，而酸杆菌门能够降解复杂的木质素和纤维素，改善土壤养分供应[28-31]。因此，覆膜栽培不仅对细菌群落产生了选择性抑制作用，还促进了有益细菌的生长，间接影响烤烟生长。
覆膜栽培模式优劣受到土壤养分、酶活性和微生物群落结构多重因素的综合影响，且相互之间存在较为复杂的关联性。相关研究发现土壤氮素与磷素、钾素相比更能影响土壤微生物群落结构，与本研究差异较大[32]。本研究发现有效磷、速效钾和蔗糖酶是影响土壤细菌群落的关键因子。在整个生育期内碱解氮变化不大，但有效磷、速效钾呈现上升趋势，且覆膜条件下总体高于裸土栽培处理，是驱动土壤细菌群落变化和促进细菌生长的重要因子。相关的驱动机制，及其对烟草生长的影响值得进一步研究[33-34]。蔗糖酶可通过土壤有机物物料降解改变土壤微生物所需的碳氮比及可溶性碳源，进而影响细菌群落结构[35-36]。覆膜栽培土壤蔗糖酶活性降低，减缓蔗糖分解速率，土壤碳氮比的增加影响细菌群落结构和代谢途径。
综上，覆膜栽培通过优化土壤水、热条件，显著调控了土壤肥力、酶活性及细菌群落结构，促进了烤烟的生长和生产。未来的研究应进一步探讨覆膜栽培对土壤生态系统的长期影响，尤其是不同环境因子与微生物群落间复杂的相互作用机制。
4 结论
覆膜栽培对土壤碱解氮影响较小，但提高了有效磷和速效钾的含量，尤其烤烟生长前期后者在土壤中的含量。覆膜通过改善土壤的水热条件，减少了养分淋溶流失，保障了烤烟对钾肥的需求。
覆膜栽培可通过提高土壤温度影响微生物活性，调节土壤酶活性动态，增加了酸性磷酸酶活性，促进了磷的有效利用，但同时抑制了蔗糖酶活性。
覆膜栽培提升了绿弯菌门和酸杆菌门的丰度，抑制了变形菌门和放线菌门的生长。覆膜栽培模式下土壤微生物群落结构丰度呈下降趋势。
