摘要
为了分析复种饲草对土壤微生物群落组成及酶活性的影响，采用 16S rDNA 高通量测序对复种饲草土壤中细菌和真菌群落结构，以及土壤酶活性进行分析。结果表明：（1）复种饲草土壤中微生物多样性不同，复种豌豆的过程中，土壤内生菌存在协同共进，其微生物多样性会增加，Alpha 多样性指数表明，土壤中微生物群落的 Observed species 指数、Simpson 指数、Shannon 指数和 Chao1 指数高于复种燕麦和休闲地的土壤中微生物群落的相应指数；（2）复种饲草土壤中的优势细菌和真菌存在差异，运用热图对复种不同饲草的土壤样本属水平微生物群落进行分析，结果表明，复种豌豆后土壤中的细菌 Acidibacter、Subgroup_6、Gitt-GS-136 等丰度显著提高，土壤中的真菌 Fusarium、Cylindrocarpon、Microdochium、Ophiosphaerella、Rhizopus、Lophiostoma、Actinomucor 等丰度同样显著提高；（3）复种饲草影响与土壤营养循环相关的酶活性，经过 1 个生长季节后，随着时间的推进，复种饲草土壤中酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性呈增加的趋势；多酚氧化酶活性呈降低的趋势，以藏青 2000、藏青 17、喜拉 22 和 13-5171-7 作为前茬作物复种豌豆，土壤中土壤脲酶活性分别提高 13%、4%、9% 和 14%，同时土壤中过氧化氢酶活性分别提升 4%、3%、6% 和 6%，综上所述，复种饲草对土微生物的多样性及酶活性具有一定的影响。
Abstract
In order to analyse the effect of multiple cropping forage on soil microbial community composition and enzyme activity，this study used 16S rDNA high-throughput sequencing to analyse the structure of bacterial and fungal communities in multiple cropping forage soil，as well as soil enzyme activity. The results showed that：（1）The microbial diversity in the soil of multiple cropping forage was different，and the microbial diversity increased during the replanting of pea with the presence of soil endophytes in common synergism，and the Alpha diversity index showed that the Observed species index，Simpson index，Shannon index and Chao1 index of the microbial community in the soil were higher than those of the soil of multiple cropping oat and recreational land. The indexes of microbial community in the soil were higher than those in the multiple cropping of oats and recreational land.（2）There were differences in the dominant bacteria and fungi in the soil of multiple cropping of forage grass. Heatmap analysis was used to analyze the genus level microbial communities in soil samples of different forage grasses. The results showed that after multiple cropping of peas，the abundance of bacteria such as Acidibacter，Subgroup-6，Gitt-GS-136 in the soil significantly increased，and the abundance of fungi such as Fusarium， Cylindrocarpon，Microdochium，Ophiosphaerella，Rhizopus，Lophiostoma，Actinomucor in the soil also significantly increased；（3）Multiple cropping of forage could affect enzyme activity related to soil nutrient cycling. After one growing season，with the passage of time，the activities of acid phosphatase，sucrase，and urease in the soil of multiple cropping forage showed an increasing trend；polyphenol oxidase showed a decreasing trend. When peas were replanted with Zangqing 2000，Zangqing 17，Xila 22，and 13-5171-7 as previous crops，soil urease activity increased by 13%，4%，9%， and 14%，respectively. At the same time，soil catalase activity increased by 4%，3%，6%，and 6%，respectively. In summary，intercropping forage had a certain impact on soil microbial diversity and enzyme activities.
西藏地域的气候资源十分丰富，在 20 世纪 80 年代已开展青稞复种的研究，近几年复种制度在西藏的中东部河谷农区取得了一定的应用。农田生态系统中，微生物群体扮演着不可或缺的角色，在土壤有机质的降解、转换及循环过程中发挥着积极的推动作用。实施复耕可以显著提升土壤中有益菌的数量，同时减少有害菌的存在，进一步提高微生物的活跃度。这些微生物和土壤酶不单是土壤有机质转换的催化剂，也是植物所需营养元素的动态储存库，它们作为土壤的关键部分，可以敏感地反映出土壤的施肥效率和健康状态[1-2]。在生态系统的物质与能量交换中，微生物起着至关重要的作用，推动土壤有机质的矿物质转化和腐殖质形成，是土壤养分转换和循环的核心动力[3]。土壤微生物群落的多样性和稳定性揭示了土壤的营养水平，并进一步影响植物的发育和对环境的适应力[4-5]。土壤酶的活性是衡量土壤肥力、质量和健康的重要生物化学指标，与土壤的物理化学性质、类型、施肥方式、耕作方法及其他农艺措施紧密相连，在土壤的物质循环和能量转换中占据着关键地位[6-8]。因此，利用土壤微生物多样性和土壤酶活性指标来评价土壤质量已经逐渐成为农业研究的新焦点[9-10]。研究显示，适当的复耕措施能够有效改善土壤的物理特性、结构以及水分状况，显著优化土壤微生物群落结构，促进土壤酶活性之间的互动，从而提升土壤肥力，有助于增加作物产量，推动农业向生态友好、绿色可持续的方向发展[11-13]。
青藏高原地带气候严酷，气温低，氧气稀薄，日间与夜间温差显著，辐射强烈，孕育了独有的生态系统和生物宝藏。在极端恶劣的环境中，植被与土壤中的微生物经过漫长岁月的适应，形成了一套错综复杂且稳固的共生网络[14-15]。近期，这一地区的特殊性吸引了众多国内外研究者对高原极端环境土壤微生物多样性的深入研究[16]，特别是植物与土壤微生物之间的互动关系，已成为研究领域的热点之一[17-18]，因此，本研究通过高通量测序技术，测定西藏不同复种方式后土壤微生物群落结构及土壤酶活性相关指标，以期为探寻该地区合理的复种方式提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
研究在西藏自治区农牧科学院下属农业研究所的第五试验田实施，土壤类型为草甸土，后经过耕种熟化为潮土，质地砂壤土，pH 值 7.45。该地点海拔高达 3623.29 m，地理坐标为北纬 29.638313°，东经 91.031832°。该试验田之前种植的是青稞作物，地形保持水平，土壤初始肥力状况为有机质 11.07 g/kg、全氮 1.05 g/kg、全磷 0.64 g/kg、有效磷 9.47 mg/kg、速效钾 42.67 mg/kg、碱解氮 75.67 mg/kg。
1.2 试验设计
鉴于前茬作物的差异及复种模式的多样性，本次试验布置了 36 种不同的处理方案，每个方案重复 3 次，采用随机排列的区组设计（拉丁方）进行田间小区试验，每个小区的面积为 20.01 m2。所选用的前茬作物包括 13-5171-7、喜拉 22、藏青 17 和藏青 2000 4 种，而复种方式则分为 3 类：一类是复种南箭 1 号豌豆，一类是复种青海 444 燕麦，还有一类作为空白对照，即不进行复种饲草的种植方式。
1.3 试验方法
试验于 2021 年 3—11 月进行，在青稞试验材料播种前、青稞试验材料收割完毕时、青稞试验材料与箭舌豌豆及燕麦复种后的地块，进行土壤样本的采集。土壤采样深度 0～20 cm，蛇形取样，5 点形成 1 个混合样。
1.4 数据处理
运用 Excel 2003 制作表格，利用 SPSS 19.0 对所得数据进行统计分析以检验其显著性。在 OMEGA 公司提供的 Soil DNA Kit 辅助下提取 DNA 样本，并对提取出的 DNA 样本进行质量检测。通过荧光光度计（ 型号为 Quantifluor-ST fluorometer，生产商为 Promega，编号为 E6090；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，生产商为 Invitrogen，编号为 P7589）在 260 和 280 nm 波长下测定 DNA的吸光度，以确定 DNA 的浓度。此外，采用 1% 琼脂糖凝胶电泳法对 DNA 样本的纯度进行评估。将 DNA 溶液的浓度调整至适宜水平，并将 DNA 工作液在4℃下保存，而储存液则在-20℃下冷藏。
2 结果与分析
2.1 复种饲草对土壤微生物群落结构的影响
2.1.1 细菌群落 Alpha 多样性分析
对复种饲草土壤中生微生物多样性不同指数进行统计计算分析，选取 Chao1 指数，Shannon 指数、Simpson 指数和 Observed species 指数进行分析，用这些指数来评估和分析复种饲草土壤微生物群落的 Alpha 多样性，指数数据越大，表明其相对微生物群落的多样性和丰富度越高。图1所示，箱线图直观呈现了不同处理下的 Alpha 多样性指数分布，观察中位线的位置高低可以判断各指数的大小，其中 Simpson 指数在不同处理组间表现出显著的差异性（P=0.003<0.05）。复种豌豆的土壤中细菌 Observed species 指数、Simpson 指数、Shannon 指数和 Chao1 指数高于复种燕麦及无复种饲草的土壤中细菌，说明复种豌豆过程中其内生菌存在协同共进，其微生物多样性会增加，导致复种豌豆土壤微生物多样性明显高于复种燕麦及无复种饲草的土壤。
2.1.2 细菌群落 Beta 多样性分析
Beta 多样性研究旨在探究各类样本群落数量的共通点。常规做法是运用主成分分析法（PCA）。此法通过线性转换，将原本多维度的数据经过转换后，映射至较低维度的坐标系，实现数据降维和结构简化，揭示样本的自然分布。PCA 分析能从原始数据中提炼出样本间最显著的区别特征，并依据这些特征在新的低维坐标系中对样本进行排列，确保样本在新坐标系中的位置差异尽可能反映其真实差异。在排序过程中，每个坐标轴对原始数据中样本差异的解释程度逐渐降低。通过自然分解群落数据结构并对样本进行排列，以便观察样本间的差异。
通过 PCA 分析所绘制的图2显示：在横轴上展现的是第一主成分（PC1，占比 58.5%），而在纵轴上则反映了第二主成分（PC2，占比 16.1%），这两个主成分相加的累计贡献度达到了 74.6%。
图1细菌多样性指数分组箱线图
注：A1：前茬藏青 2000；A2：前茬藏青 17；A3：前茬喜拉 22；A4：前茬 13-5171-7；B1：空白；B2：复种燕麦；B3：复种豌豆。图2～6 同。 * 代表 P<0.05，** 代表 P<0.01，*** 代表 P<0.001。图4 同。
图2复种不同饲草对土壤细菌 Beta 多样性的影响
2.1.3 细菌群落热图分析
为进一步比较不同处理间的细菌物种组成差异，运用热图对复种不同饲草的土壤样本属水平细菌群落进行分析，物种的丰度热图可以直观地观察出菌群之间的丰度差异，颜色越红代表菌群之间丰度越大，同时差异就越大，颜色越蓝代表菌群丰度越小。结果如图3所示，其中前茬藏青 2000，Devosia 是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Acidibacter、Subgroup_6、Gitt-GS-136 是复种豌豆后土壤中丰度较高的细菌；前茬藏青 17， IMCC26256、Arthrobacter、Latescibacteria、MB-A2-108、KD4-96、Gaiella 是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Acidibacter 是复种豌豆后土壤中丰度较高的细菌；前茬喜拉 22，Promicromonospora 是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Bryobacter、S085、 JG30-KF-CM66、Pedomicrobium、Hyphomicrobium 是复种豌豆后土壤中丰度较高的细菌；前茬 13-5171-7，Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 是复种燕麦后土壤中的优势微生物， Haliangium、Iamia 是复种豌豆后土壤中丰度较高的细菌。说明复种饲草土壤中的优势细菌存在差异。
图3属水平细菌丰度热图
2.1.4 真菌群落 Alpha 多样性分析
选取 Chao1 指数，Shannon 指数，Simpson 指数和 Observed species 指数来表征不同处理真菌群落的 Alpha 多样性，指数数据越大，表明其相对微生物多样性和丰富度越高。由图4所示箱线图可知，真菌的微生物多样性规律与细菌的微生物多样性规律存在不同，Chao1 指数（P=0.021<0.05）表示不同处理间具有显著差异。
复种豌豆的土壤中真菌 Observed species 指数、 Simpson 指数、Shannon 指数和 Chao1 指数高于复种燕麦及无复种饲草的土壤，说明复种豌豆过程中其内生菌存在协同共进，其微生物多样性会增加，导致复种豌豆土壤微生物多样性明显高于复种燕麦及无复种饲草的土壤。
2.1.5 真菌群落 Beta 多样性分析
图5揭示了土壤中真菌 Beta 多样性在不同复种饲草条件下的显著变化，其中横轴代表第一主成分（PC1，占比 38.2%），纵轴则对应第二主成分（PC2，占比 21.1%），这两个主成分共同解释了 59.3% 的变异。与细菌相比，真菌 Beta 多样性的差异相对较小。
2.1.6 真菌群落热图分析
为进一步比较不同处理间的真菌物种组成差异，运用热图对复种不同饲草的土壤样本属水平真菌群落进行分析，由图6可知，前茬藏青 2000，Pseudogymnoascus、Mycosphaerella、Exophiala、 Aspergillus、Sarocladium 是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Botryotrichum 是复种豌豆后土壤中丰度较高的真菌； 前茬藏青 17，Olpidium、Acremonium、 Humicola 是复种燕麦后土壤中的优势微生物， Didymella 是复种豌豆后土壤中丰度较高的真菌；前茬喜拉 22，Conocybe、Metarhizium、Bipolaris、Lecythophora是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Fusarium、 Cylindrocarpon、Microdochium、Ophiosphaerella、 Rhizopus、Lophiostoma、Actinomucor 是复种豌豆后土壤中丰度较高的真菌；前茬 13-5171-7，Zopfiella、 Fusariella、Podospora、Ilyonectria、Funneliformis、 Clonostachys、Cyphellophora、Neonectria 是复种燕麦后土壤中的优势微生物，Schizothecium、Gibberella 是复种豌豆后土壤中丰度较高的真菌。说明复种饲草土壤中的优势真菌存在差异。
图4真菌多样性指数分组箱线图
图5复种不同饲草对土壤真菌 Beta 多样性的影响
图6属水平真菌丰度热图
2.2 复种饲草对青稞地耕层土壤酶活性的影响
微生物的代谢产物与植物根部分泌物共同构成了土壤酶的主要来源，这些酶是执行特定催化作用的蛋白质颗粒。研究表明，土壤中存在多达 50 至 60 种不同的酶。土壤酶的活跃程度与土壤的肥沃程度以及微生物的数量呈正比，同时，土壤酶的活性也与土壤的构造有着密切的联系。本试验对过氧化氢酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶以及多酚氧化酶的活性进行了检测。
2.2.1 对土壤营养循环相关的酶活性的影响
不同的复种方式对土壤营养循环相关的酶活性有影响，经过 1 个生长季节后，随着时间的推进，复种豌豆、燕麦的土壤中酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性均有增加的趋势，各处理间差异不显著（P>0.05），复种豌豆较复种燕麦增加土壤中酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性的幅度高。
与无复种饲草相比，相较于未种植牧草，在种植藏青 2000 后继种豌豆和燕麦的土壤中，酸性磷酸酶的活性分别提升了 15% 和 1%；在种植藏青 17 后继种豌豆和燕麦的土壤中，该酶活性分别提升了9 % 和 5%；在种植喜拉 22 后继种豌豆和燕麦的土壤中，该酶活性分别提升了 16% 和 13%；在种植 13-5171-7 后继种豌豆和燕麦的土壤中，该酶活性分别提升了 13% 和 5%（图7）。
图7复种饲草对土壤酸性磷酸酶活性的影响
注：不同大写字母表示相同复种方式不同前茬作物间的显著性，不同小写字母表示相同前茬作物复种饲草间的显著性（P<0.05）。下同。
与无复种饲草相比，前茬藏青 2000 复种豌豆、燕麦条件下土壤蔗糖酶活性分别增加 12%、 2%；与无复种饲草相比，前茬藏青 17 复种豌豆、燕麦条件下土壤蔗糖酶活性分别增加 13%、3%； 与无复种饲草相比，前茬喜拉 22 复种豌豆、燕麦条件下土壤蔗糖酶活性分别增加 8%、2%；与无复种饲草相比，前茬 13-5171-7 复种豌豆、燕麦条件下土壤蔗糖酶活性分别增加 10%、5% （图8）。
相较于未进行复种饲草的情况，在藏青 2000 作为前茬作物复种豌豆和燕麦时，土壤脲酶活性分别提升了 13% 和 5%；在藏青 17 作为前茬作物复种豌豆和燕麦时，土壤脲酶活性分别提升了 4% 和 3%；在喜拉 22 作为前茬作物复种豌豆和燕麦时，土壤脲酶活性分别提升了 9% 和 8%；在 13-5171-7 作为前茬作物复种豌豆和燕麦时，土壤脲酶活性分别提升了 14% 和 8%（图9）
图8复种饲草对土壤蔗糖酶活性的影响
图9复种饲草对土壤脲酶活性的影响
2.2.2 对土壤结构改善相关的酶活性的影响
根据表1的数据显示，各类复种模式对土壤结构优化相关的酶活性产生了不同影响。在经历了一个完整的生长周期之后，随着时间的推移，采取豌豆和燕麦复种的土壤中，过氧化氢酶活性呈现出上升的态势，尽管不同处理之间的差异并不显著 （P>0.05），然而，豌豆复种相比燕麦复种在提升土壤过氧化氢酶活性方面具有更明显的增长幅度。同时，豌豆和燕麦复种的土壤中，多酚氧化酶活性显示出下降的趋势，各组处理间的差异同样不显著 （P>0.05），但是豌豆复种在减少土壤多酚氧化酶活性方面的下降幅度大于燕麦复种。
表1复种饲草下土壤过氧化氢酶活性和多酚氧化酶活性
相较于未进行复种的饲草，藏青 2000 茬后种植豌豆和燕麦的土壤中过氧化氢酶活性分别提升了 4% 和 0.2%；在藏青 17 茬后种植豌豆和燕麦的情况下，土壤过氧化氢酶活性分别比未复种时提高了 3% 和 0.8%；在喜拉 22 茬后种植豌豆和燕麦，土壤过氧化氢酶活性则分别较未复种时增加了 6% 和 3%；在 13-5171-7 茬后种植豌豆和燕麦，土壤过氧化氢酶活性分别较未复种状态增加了 6% 和 0.2%（表2、图10）。
图10复种饲草对土壤过氧化氢酶活性的影响
与无复种饲草相比，在种植藏青 2000 后继种豌豆和燕麦的土壤中，多酚氧化酶的活性分别减少了 8% 和 1%；在种植藏青 17 后继种豌豆和燕麦的土壤中，多酚氧化酶的活性分别减少了 11% 和 1%；在种植喜拉 22 后继种豌豆和燕麦的土壤中，多酚氧化酶的活性分别减少了 5% 和 6%；在种植 13-5171-7 后继种豌豆和燕麦的土壤中，多酚氧化酶的活性分别减少了 7% 和 2%（表2、图11）。
图11复种饲草对土壤多酚氧化酶活性的影响
3 讨论
保持土壤微生物多样性对于改善土壤结构、提升土壤肥力和减少化肥农药的施用至关重要，这有利于农业生态系统的可持续发展。当土壤中微生物种类丰富时，土壤的肥沃程度会显著提高[19-20]。采取适当的农业耕作措施可以有效调控土壤养分的循环和平衡，从而增强土壤肥力[21-22]。研究表明，在青稞与箭舌豌豆、马铃薯等作物的轮作试验中，与单一作物种植或间作模式相比，粮食产量有显著提高。长期轮作能够显著增加土壤微生物的数量，优化微生物群落结构，这对于提高土壤肥力和改善微生物群落结构具有极其重要的意义[23-24]。西藏作为一个气候多样的高海拔地区，拥有丰富的气候资源。在其河谷地区，每年 7 月中旬冬播作物收割完毕后，田地将进入 90 至 110 d 的休闲期，直到新一季作物播种。这一时期正值西藏的雨季，降水量占全年的七成以上，雨水和热量的同步到来为复种饲料充分利用土地、光照和降水提供了得天独厚的条件。
复种饲料不仅能够开发利用秋冬闲田，充分利用北方自然资源，提高土地利用率，还能保护生态环境，提升土壤肥力，解决冬春饲料短缺问题，增加社会生态和经济效益。这是西北地区农业生产可持续发展的有效措施之一，具有广阔的发展前景。本研究通过田间小区试验，重点关注土壤基础养分和微生物群落，采用 16S 和 18S 高通量测序技术分析了复种后土壤中的微生物，揭示了复种对土壤微生物群落结构和多样性的改善作用，增加了有益菌群，促进了养分循环，并有助于提高酶活性。复种包括在同一地块上一年内连续种植多季作物的水平复种和间套作两种形式，这不仅提高了土地产出效率，还最大化地利用了冬季和春季的光热资源，增加了植被覆盖面积，提高了土地和热能的利用效率。与单一作物种植相比，复种显著提高了水分和土地生产力，以及经济效益。在复种作物中加入具有固氮功能的豆科牧草有助于显著减少氮肥的使用量。
本研究数据显示，在青稞与箭舌豌豆轮作的土壤中，Observed species 指数、Simpson 指数、 Shannon 指数和 Chao1 指数均高于燕麦轮作和休闲土壤中的相应指数，这一结果与 Gao 等[25]和王劲松等[26]的研究结果相一致。土壤的肥沃程度及其物理化学特性可以通过土壤酶的活性来体现，这种活性在将土壤中复杂的有机质分解成植物和微生物可吸收的营养成分过程中扮演着关键角色[8，27]。研究结果表明，复种饲草对土壤酶活性产生了影响；经过 1 个生长季后，随着时间推移，复种饲草土壤中的酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性呈上升趋势，而多酚氧化酶活性则呈下降趋势，这与李锐等[28]和赵亚丽等[29]的试验结论基本相符。然而，在本试验的不同处理组之间并未观察到显著差异，这可能与地域差异[30-31]、复种年限[32]等因素有关，需要进一步研究。
4 结论
本研究发现，在复种饲草的土壤里，微生物的种类繁多性存在差异，具体表现在复种豌豆土壤的微生物群落中，检测到的 Observed species 指数、 Simpson 指数、Shannon 指数和 Chao1 指数均高于复种燕麦和休闲土壤的微生物群落相应指数；复种饲草对土壤酶的活性产生了明显作用，在 1 个生长周期结束后，随着时间推移，复种饲草的酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶活性逐渐上升；而多酚氧化酶的活性则呈现下降走势，不同处理之间的差异并不显著。