摘要
为发掘多功能、作用高效的耐低温根际促生菌（PGPR）菌株，以白菜型冬油菜‘陇油 7 号’根际土壤为研究材料，通过平板划线法分离可培养根际菌株，并根据形态特征及 16S rRNA 基因确定其分类地位，评价其抗逆性、产酶和生理生化特性以及促生效果。结果表明：从‘陇油 7 号’根际土壤筛选出命名为 a-1、c、c-1、d、 h、j 和 z 的 7 株 PGPR，其中 4 株具解钾能力，3 株具产铁载体。进一步分析发现，h 菌株解钾能力最好，其溶钾量高达 217.16 mg/L，c-1 菌株产铁载体能力最强，可溶性指数（D/d 值）达 3.43；分离的 7 菌株中，仅 a-1 菌株溶无机磷，其 D/d 值为 1.53。分析菌株的产酶特性发现，j、c、h 和 z 菌株分别具有较强的产果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的能力，其 D/d 值分别为 3.23、3.29、2.55 和 4.14；对菌株抗逆性分析发现，a-1、h 和 z 菌株在聚乙二醇 -6000 质量浓度 25%（水势为 -0.73 MPa）干旱胁迫下生长状态较好，c、c-1 和 d 菌株的耐盐（NaCl） 质量浓度可达 8% ～ 10%，a-1、c-1 和 h 菌株可耐低温（4℃）；促生试验结果表明，3 株耐低温（4℃）菌株均对冷敏感白菜型冬油菜‘天油 4 号’种子的萌发有促生作用，其中 c-1 菌株促生效果最佳，其胚芽、胚根的长度分别增加了 27.68% 和 38.04%；利用 16S rRNA 基因序列同源性分析鉴定菌株结果表明，a-1 和 h 菌株为假单胞菌属（Pseudomonas），c-1 菌株为近芽孢杆菌属（Peribacillus），d 菌株为微杆菌属（Microbacterium），j 菌株为尼尔菌属（Niallia），z 菌株为芽孢杆菌属（Bacillus）。综上所述，从白菜型冬油菜‘陇油 7 号’根际土壤中筛选出的 a-1、c、c-1、d、h、j 和 z 菌株具解钾、产酶、耐干旱和耐盐胁迫等多种功能，且耐低温菌株有不同程度的促生效果。该研究结果丰富了白菜型冬油菜菌种资源，为冬油菜的抗寒栽培提供理论依据。
Abstract
In order to explore multi-functional and high-effective low-temperature-tolerant and plant growth promoting rhizobacteria （PGPR）strains，the study isolated culturable PGPR strains from the rhizosphere soil of‘Longyou 7’winter turnip rape varieties by plate streaking method. The taxonomic status of these strains was determined according to morphological characteristics and 16S rRNA gene，and the stress-tolerance，enzyme production characteristics，physiological and biochemical characteristics as well as growth-promoting effect of these strains were further evaluated. The results indicated that 7 PGPR strains named a-1，c，c-1，d， h，j and z were screened from the rhizosphere soil of‘Longyou 7’. Among them，4 strains had the potassium solubilizing capacity， and 3 strains had the siderophore producing ability. Further analysis showed that strain h had the best potassium solubilizing capacity，and it could dissolve potassium up to 217.16 mg/L. Strain c-1 had the strongest siderophore producing ability，and its soluble index（D/d value）was 3.43. Among the 7 strains，only a-1 strain dissolved inorganic phosphorus，and its soluble index was 1.53 . The strain j，c，h and z had strong ability to produce pectinase，cellulase，protease and amylase，and their D/d values were 3.23，3.29，2.55 and 4.14，respectively. Strains a-1，h and z grew well under drought stress with 25% PEG-6000（ -0.73 MPa water potential）. Strains c，c-1 and d could tolerate 8%-10% NaCl concentration，and strains a-1，c-1 and h could tolerate low temperature at 4℃ . The results of the growth-promoting test showed that three low-temperature-tolerant strains（a-1，c-1 and h） had a growth-promoting effect on the germination of cold-sensitive winter rapeseed seeds‘Tianyou 4’，and the strain c-1 had the best growth-promoting effect. The length of embryo and radicle of‘Tianyou 4’increased by 27.68% and 38.04%，respectively. The identification of PGPR strains using 16S rRNA gene sequence homology analysis determined that strains a-1 and h，c-1，d，j and z were Pseudomonas，Peribacillus，Microbacterium，Niallia，and Bacillus，respectively. In conclusion，PGPR strains screened from‘Longyou 7’PGPR strains had various functions such as potassium solubilization，enzyme production，drought tolerance and salt stress，and the low-temperature-tolerant strains had growth-promoting effects. Therefore，PGPR strains detected in this study enriched the bacterial resources of winter rapeseed，and provided technical and theoretical support for the cold-tolerant cultivation of winter turnip rape.
油菜（Brassica napus L.）是我国第一大油料作物，是食用植物油和植物蛋白的主要来源，具有适应性强、用途广泛、多维度的生态经济价值等优势[1]，在我国农业生产中发挥重要作用。根据油菜播种季节不同可分为冬油菜和春油菜。北方地区因其气候严寒、缺少抗寒品种，冬油菜难以越冬，只能种春油菜，随着抗寒冬油菜新品种的成功培育，河西走廊也成为我国冬油菜新产区[2]。孙万仓等[3]认为，冬油菜是西北寒旱区唯一冬季油料作物，种植冬油菜具有显著的经济效益和生态效益，但还存在越冬率不高和产量不稳定等问题。
微生物是土壤的重要组成部分，在土壤物质循环、生态平衡和植物生长等方面起着关键作用。植物根际促生菌（PGPR）是生长在植物根周围或根表面的土壤中，能够产生和分泌各种物质直接或间接刺激植物生长的一类有益细菌，其可通过解磷、解钾、固氮、产植物激素等直接促进植物生长和作物增产[4-7]。Mishra 等[8]从喜马拉雅山植物根际分离出一株能耐受 4℃低温的假单胞菌，可通过解磷、分泌植物激素等促进小麦幼苗生长；王红珠等[9]筛选出耐铅细菌 GZ01，通过合成 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶、分泌吲哚乙酸（IAA）、产铁载体、溶磷等功能增加宿主植物大豆的生物量。此外，接种 PGPR 也可增强植物对逆境的耐受性，如 Bharti 等[10] 发现接种耐盐PGPR 可增强植物抗氧化能力、降低盐毒性而提高作物产量；徐雪东等[11]发现在干旱胁迫下施用耐旱 PGPR 可以提高苹果幼苗的抗旱性。因此，植物根际促生菌资源的筛选已成为人们研究的热点。白菜型冬油菜分布在我国北纬 34°以北地区[3]，其能在该地区安全种植除自身具有优良的耐寒基因和遗传基础外，还可能与其体内、外微生物的耐寒功能有关。但目前许多研究都聚焦冬油菜抗寒机制[12-13]，而其耐低温促生菌资源的研究报道较少。因此，挖掘适应北方寒旱区耐低温 PGPR，用于开发新型微生物肥料以增强该地区冬作物耐寒性和产量具有重要意义。
本研究以强抗寒白菜型冬油菜‘陇油 7 号’根际土壤为研究对象，对其可培养细菌进行分离和纯化，采用形态观察、抗逆性测定、产酶、促生和生理生化特性研究及 16S rRNA 基因确定菌株分类地位，以期丰富白菜型冬油菜根际内生菌资源，为冬油菜的抗寒栽培提供科学依据。
1 材料与方法
试验在河西学院农业与生态工程学院教学科研示范基地（海拔 1474 m，北纬 38°57′09″，东经 100°26′21″）进行，年平均日照时间 3065.6 h，年均气温 7.3℃，最低气温-28.7℃。试验地前茬为春小麦，2021 年 8 月 22 日播种，播前结合翻耕整地施足基肥，开沟条播，播深 3～5 cm，行距 20 cm，株距 15 cm，密度为 60 万株 /hm2，小区面积为 10 m2 （2 m×5 m），3 次重复，随机区组排列。8 月 29 日出苗，9 月 14 日间（定）苗，此后常规管理。
1.1 试验材料
白菜型冬油菜品种‘陇油 7 号’由甘肃省油菜工程技术研究中心选育，冬油菜根际土样于 2021 年 11 月下旬在冬油菜生长至枯叶期（平均最低气温-15℃左右）时试验田采集，不同区域采样 8 份，低温冷藏保存。
培养基为 PKO（Pikovaskaia’s 培养基）无机磷培养基[14]；钾长石固体培养基（改良解钾培养基中添加 100 mg/L 溴麝香草酚蓝）[15-16]；NB（NB Medium）培养基[17]； 铬天青（Chrome azural S， CAS）检测培养基[17]；果胶酶筛选培养基[18]；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基[19]；酪素培养基[20]；淀粉培养基[21]等。
1.2 试验方法
1.2.1 土样采集和处理
采用五点取样法，每个样点采集 10 株白菜型冬油菜，挖取冬油菜完整植株根部，通过抖根法去除与根系结合松散的大块土壤后，用软毛刷收集附着于根系表面的土壤于无菌管中作为根际土[22]，将采集的样品立即带回实验室，置于 4℃冰箱冷藏保存，并尽快进行微生物的分离和筛选。具体方法：在超净工作台上将 5 个位点的根际土壤混合均匀，称取 5 g 土壤样品，转入含有无菌玻璃珠和盛有 95 mL 无菌水的三角瓶，30℃、160 r/min 振荡 2 h。将土壤悬浮液进行梯度稀释，即得到原液、 10-1、10-2、10-3、10-4 共 5 个浓度梯度的土壤悬浮液。
1.2.2 根际土壤细菌的富集培养
稀释涂布平板法：分别吸取各浓度梯度的土壤悬浮液，涂布于 NB 培养基上，在 37℃下培养 48 h。在此期间及时观察各培养基中菌落的生长情况，并记录菌落的数目和形态特征等。
1.2.3 根际土壤细菌的分离纯化
平板划线法：在富集培养的平板上挑取具有不同特征的单菌落于 NB 培养基上划线，37℃恒温培养 24 h，直至分离出单一菌株，将单菌落接种于斜面培养基中培养后，置于 4℃冰箱暂时保藏，后期保存至甘油管，在-80℃冰箱对菌株进行长期保存。
1.2.4 菌株形态特征鉴定
菌落形态观察：将菌株接种于 NB 培养基上于 37℃恒温培养 48 h，观察并记录菌落的形态特征及生长状况，包括大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起状态和边缘特征等。
革兰氏染色[23]：将 NB 培养基上培养 24 h 的菌落挑取并涂布于载玻片上，经革兰氏染色后，在油镜下观察，菌体呈紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌，描述其大小、形状和有无芽孢等特征。
1.2.5 菌株抗逆性检测
耐低温菌株的检测：挑取前期分离纯化得到的菌株，在 NB 培养基上划线，分别置于 4℃（低温）、25、30、37℃下恒温培养 72 h，观察各菌株的生长状况，筛选出耐低温菌株。
耐干旱菌株的检测：利用聚乙二醇（PEG）-6000 增加液体培养基的渗透压，人工模拟干旱环境条件[24]，以鉴定耐干旱菌株。将前期分离纯化所得菌株分别接种于含有 PEG-6000 质量浓度为 0（CK）、15%、25%、35% 的 NB 液体培养基中，其对应水势分别为 0、-0.30、-0.73、-1.37 MPa， 37℃、140 r/min 下培养 4 d，期间观察培养基的变化。在 600 nm 处测定菌液的光密度值（OD）[25]，以分析菌株在不同干旱环境下的生长状况，筛选出耐干旱的菌株。
耐盐菌株的检测：用不同浓度的 NaCl 模拟盐胁迫环境，将菌株分别接种于含有 NaCl 质量浓度为 0（CK）、2%、4%、6%、8%、10% 的 NB 固体培养基中，培养 72 h，观察记录各菌株的生长状况，以确定具有耐盐能力的菌株及其耐盐程度。
1.2.6 菌株促生特性鉴定
解钾菌株的筛选：解钾菌的初筛，参考孙金凤等[15]的方法，挑取 NB 培养基上长势良好的单菌落，采用点接种法接种于改良的解钾培养基上，一个培养皿 4 个点，37℃培养 5 d，观察长出的菌落周围是否产生明显的解钾圈，若有解钾圈即为解钾菌株。测量其解钾圈直径（D）和菌落直径（d），并计算可溶性指数（D/d）值，根据可溶性指数的大小判断菌株的解钾能力。解钾菌的复筛：参考王珣珏等[26]的方法稍作修改，将初筛具有解钾能力的菌株接种于以钾长石为唯一钾源的液体培养基中，37℃、160 r/min 培养 48 h。取菌液 5 mL，8000 r/min 离心 10 min，取上清液 2 mL，加 8 mL 2% 的 HNO3 溶液，用原子吸收分光光度计测定上清液中可溶性钾的含量。
产铁载体菌株的筛选：参考荣良燕等[27]铁载体定性检测方法，用灭菌的牙签将菌株接种于 CAS 培养基上，37℃培养 72 h，观察长出的菌落周围是否产生明显的淡黄色铁螯合圈，若有淡黄色晕圈即为产铁载体菌株。测量其晕圈直径（D）和菌落直径（d），并计算晕圈与菌落直径的比值（D/d），对菌株分泌铁载体能力进行比较分析，以判断产铁载体能力强的菌株。
无机磷溶解菌株的筛选：将菌株点接于 PKO 无机磷培养基上，37℃培养 5 d，观察长出的菌落周围是否产生明显的透明溶磷圈，测量并计算 D/d 值以筛选出溶磷菌株。
1.2.7 菌株产酶特性鉴定
产果胶酶菌株的筛选：参考彭洁英等[28]的方法，挑取 NB 培养基上长势良好的单菌落，点接种于以果胶为唯一碳源的果胶酶筛选培养基上，37℃ 培养 3 d，观察菌落的生长状况。若生长状况良好，则可用浓度为 5 mg/mL 的刚果红溶液浸泡平板培养基，静置 15 min 后，倒去刚果红溶液。加入浓度为 1 mol/L 的 NaCl 溶液冲洗平板 3 次，再用其浸泡 10 min，倒掉 NaCl 溶液。此时产果胶酶的菌落周围将会出现明显的透明圈，测量并计算 D/d 值。
产纤维素酶菌株的筛选：参考黄翠欣等[29]的方法，将菌株接种于 CMC-Na 培养基上，37℃培养 3 d，若菌株生长状况良好，则可用刚果红染色法使培养基中形成以纤维素酶产生菌为中心的透明圈直径（D）和菌落直径（d），测量并计算 D/d 值，通过是否产生透明圈以及透明圈的大小来筛选纤维素酶产生菌。
产蛋白酶菌株的筛选：将菌株点接于含有 0.4% 溴麝香草酚蓝溶液的酪素培养基上，37℃培养 48 h，观察长出的菌落周围是否有蓝色水解圈，测量并计算 D/d 值。
产淀粉酶菌株的筛选：挑取菌株接种于筛选培养基，37℃培养 2 d 待菌落长出，向淀粉培养基中滴加适量卢戈氏碘液，静置 5 min 后倒去，用蒸馏水冲洗 5 次，此时产淀粉酶的菌落周围将会出现清晰的透明圈[30]，测量并计算 D/d 值。
1.2.8 菌株生理生化特性鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》[31]的方法，分别进行甲基红试验、吲哚试验、明胶液化试验、氧化-发酵反应、色氨酸脱氨酶试验、过氧化氢酶试验和乳糖发酵反应，以鉴定细菌的生理生化特性。
1.2.9 16S rRNA 基因鉴定及系统发育树的构建
菌液离心后将菌体送至上海达澈生物科技有限公司，提取各菌株的基因组 DNA，PCR 扩增 16S rRNA 基因序列完成测序。根据测序拼接结果在 NCBI 数据库中进行 BLAST 同源性对比分析[29]，选择亲缘最近的 1 个菌株和亲缘较远（序列同一性百分比 <98.6%）的 9 个菌株下载序列，使用 MEGA 11.0 以 Neighbor-Joining 方式构建系统发育树，运用 itol 系统美化系统发育树，根据菌株的亲缘关系确定菌株的分类学地位[32]。
1.2.10 耐低温菌株促生试验
根据董晓雪[33] 的方法稍作修改，验证筛选得到的耐低温菌株对白菜型冬油菜种子的促生效果，选取大小一致且饱满无损伤的‘天油 4 号’种子，消毒杀菌，均匀置于铺有湿润无菌滤纸的培养皿中，每个培养皿 30 粒种子，每个处理 3 次重复，试验组用浓度为 106 CFU/g 的菌液处理，对照组加入等量无菌水，于 4℃条件下培养 7 d，每组处理随机取 10 粒萌发冬油菜种子，直尺法测量其胚芽和胚根长度。
1.3 数据处理
采用 Excel 2016 进行数据处理，运用 MEGA 11.0 构建菌株系统发育树以及 itol 系统对其进行美化。
2 结果与分析
2.1 白菜型冬油菜根际细菌的分离纯化
通过稀释涂布平板法和平板划线法筛选出命名为 a-1、c、c-1、d、h、j 和 z 的白菜型冬油菜根际菌株（图1Ⅰ-Ⅶ）。
2.2 菌株形态特征鉴定
将分离纯化所得白菜型冬油菜根际菌株进行形态特征观察和革兰氏染色，结果见图1Ⅰ′-Ⅶ′、表1。
图1白菜型冬油菜根际土壤细菌的菌落形态（Ⅰ-Ⅶ）及革兰氏染色（Ⅰ′-Ⅶ ′）
表1白菜型冬油菜根际菌落形态鉴定及革兰氏染色结果
2.3 菌株耐低温检测
将菌株接种至 NB 培养基中置于不同温度梯度下，培养 3 d 后观察菌株生长情况（表2）。菌株 a-1、c-1 和 h 在 4℃条件下生长状态较好为耐低温菌株；菌株 d 和 z 在 4℃下有少量生长，但生长受到严重限制；菌株 c 和 j 在 4℃下无法生长，不具有耐低温能力。其中，菌株 a-1 和 h 最适生长温度为 25～30℃，菌株 c、d 和 j 的最适生长温度为 30～37℃，菌株 c-1 和 z 的最适生长温度为 25～37℃。
表2温度处理下菌株的生长变化
注：+++ 表示菌株生长状态良好；++ 表示菌株生长状态较好；+ 表示菌株生长受到限制；+-表示有菌株生长，但生长受到严重限制；-表示无菌株生长。
2.4 菌株耐干旱检测
筛选的菌株均具有一定的耐旱性，但随 PEG-6000 质量浓度的升高菌株的生存能力逐渐下降（表3）。在 PEG-6000 质量浓度为 15%（水势为-0.30 MPa）干旱胁迫下，菌株均具有耐旱性，其中菌株 a-1 的耐旱能力最强，OD 值高达 0.478，菌株 c-1、 h 和 j 次之，OD 值依次为 0.200、0.222 和 0.215；在的 PEG-6000 质量浓度为 25%（水势为-0.73 MPa） 干旱胁迫下，菌株的耐旱能力下降，其中菌株 a-1、 h 和 z 的 OD 值相对较大，耐旱性较好；在 PEG-6000 质量浓度为 35%（水势为-1.37 MPa）干旱胁迫下，菌株的生长受到严重抑制，生长量大幅下降，菌株 c、z 的耐旱能力稍强于其他菌株。综合来看，菌株 a-1、h 和 z 的耐旱性强于其他菌株。
表3干旱胁迫下菌株生长的吸光度值
注：数值为 600 nm 处的光密度值，用平均值 ± 标准误表示。
2.5 菌株耐盐检测
将菌株接种于含有不同浓度 NaCl 的培养基上观察菌株生长情况（表4）。在 NaCl 质量浓度 2% 下菌株均能正常生长。随着盐质量浓度的升高，菌株的生长量逐渐变少。在 NaCl 浓度 10% 下，菌株 c 的耐盐能力最强；菌株 c-1 和 d 次之，对 NaCl 的耐受程度可达 8%；菌株 z 在含 6% NaCl 的平板中可生长，但生长受到轻微抑制；菌株 a-1、h 对盐分的耐受性仅有 4%；菌株 j 的耐盐性最差。
表4盐胁迫下菌株生长的变化
注：+++ 表示菌株生长状态良好；++ 表示菌株生长状态较好；+ 表示菌株生长受到限制；+-表示有菌株生长，但生长受到严重限制；-表示无菌株生长。
2.6 解钾菌株的初筛及复筛
将菌株细菌点接于改良的解钾培养基上，培养 5 d，观察测量解钾圈的大小，初筛出具解钾能力的菌株（图2）。由图2A 和 B 可以看出，菌株 c、 c-1、h 和 j 的菌落周围出现了明显的黄色解钾圈，说明其具解钾功能，其中菌株 h 的解钾能力最强， D/d 值为 2.05，菌株 c-1 和 c 次之，D/d 值分别为 1.64 和 1.61，菌株 j 的解钾能力最弱，D/d 值仅为 1.35（表5）。
图2解钾菌株初筛
（A：菌株 a-1、c-1、j、h；B：菌株 c、z、d）
表5菌株促生能力的测定
注：—表示无此值，+ 表示该菌株具有固氮功能。
在钾长石为唯一钾源的选择培养基上，解钾菌株能够分解钾长石粉中的难溶性钾，使其转化为可溶性钾，由此使上清液中可溶性钾的含量增加。通过原子吸收分光光度计测定上清液可溶性钾含量 （表5），菌株 h 上清液中可溶性钾含量高达 217.16 mg/L，菌株 c-1 和 c 上清液可溶性钾含量分别为 171.77、162.36 mg/L，菌株 j 的仅达 86.10 mg/L。复筛结果与初筛结果一致。
2.7 菌株产铁载体的筛选
CAS 固体培养基呈淡蓝色，将细菌点接并培养，若为产铁载体菌株，其菌落周围会出现淡黄色铁螯合圈（图3），其可溶性指数（D/d）越大，产铁载体能力越强（表5）。由图3A 和 B 可以看出，检测的 7 株细菌中有 3 株菌株周围产生了淡黄色铁螯合圈，分别为菌株 a-1、c-1 和 h，根据其可溶性指数，其产铁载体能力从大到小顺序为菌株 c-1>h>a-1，同时这 3 株菌也具有耐低温能力 （表2）。
图3菌株产铁载体筛选
（A：菌株 a-1、z、d；B：菌株 h、j、c-1、c）
2.8 菌株无机磷溶解的筛选
由图4可以看出，分离所得的 7 株白菜型冬油菜根际土壤细菌经 PKO 无机磷培养基培养后，仅有 1 株菌株 a-1 在培养基上产生了溶磷圈，其 D/d 值为 1.53（表5）。
2.9 菌株产果胶酶筛选
果胶和纤维素是高等植物细胞壁的重要组成成分，果胶酶可以将果胶降解为小分子物质，使果胶变得容易溶解和吸收。在以果胶为唯一碳源的筛选培养基上，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物，当果胶被果胶酶产生菌分解后，可在培养基中形成以果胶酶产生菌为中心的透明圈。由图5A 和 B 可看出，刚果红染色后菌株 c-1 和 j 周围产生了透明圈，两者 D/d 值分别为 2.96 和 3.23，菌株 j 的产果胶酶能力较强（表6）。
图4菌株 c、h、j、a-1 无机磷溶解的筛选
图5菌株产果胶酶的筛选
（A：菌株 j、h、c、a-1；B：菌株 d、z、c-1）
表6菌株产酶特性定性鉴定（D/d）
注：—表示无此值。
2.10 菌株产纤维素酶筛选
将单菌落点接种在 CMC-Na 培养基上培养 3 d，刚果红染色后菌株周围产生透明圈的即为产纤维素酶菌株（ 图6）。由图6A 和 B 可以看出，菌株 c、c-1 和 z 周围产生了透明圈，其中，菌株 c 和 z 的产纤维素酶能力较好，D/d 值分别高达 3.29 和 3.21，c-1 次之，D/d 值为 1.78 （表6）。
图6菌株产纤维素酶的筛选
（A：菌株 c、h、j、a-1；B：菌株 c-1、z、d）
2.11 菌株产蛋白酶的筛选
蛋白酶可以将蛋白质分解为短肽或小分子氨基酸。在加有溴麝香草酚蓝溶液的酪素培养基上 （图7），只有 2 株菌周围产生了蓝色晕圈，菌株 h 产蛋白酶能力较好，D/d 值为 2.55，其次为菌株 a-1，D/d 值为 2.28（表6）。
图7菌株 h、c-1、j 和 a-1 产蛋白酶的筛选
2.12 菌株产淀粉酶的筛选
将菌株细菌在筛选培养基上培养，经卢戈氏碘液染色后，测量计算 D/d 值。有 5 菌株周围形成了淀粉水解圈（图8），菌株 z 的淀粉水解圈最大，D/ d 值高达 4.14，产淀粉酶效果最好，按 D/d 值大小，产淀粉酶功能由强到弱菌株顺序为 z>d>j>c>c-1。
图8菌株产淀粉酶的筛选
（A：菌株 c-1、z、d；B：菌株 j、c）
2.13 菌株生理生化特性鉴定
菌株 a-1、c、d、j 和 z 的甲基红试验结果呈阳性，仅菌株 h 的氧化-发酵反应呈阳性，除 h 外，其他 6 菌株的明胶液化结果呈阳性，菌株 a-1、 c-1、d、h 和 j 可发生过氧化氢酶反应，7 菌株的吲哚试验和乳糖发酵反应结果呈阴性（表7）。
表7菌株生理生化特性鉴定
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
2.14 16S rRNA 基因鉴定及系统发育树的构建
基于 a-1、c-1、d、h、j 和 z 菌株 16S rDNA 基因序列 Blast 比对结果，构建系统发育树，结果如图9所示。a-1 和 h 菌株聚在同一支上，a-1 与系统发育最近的 Pseudomonas koreensis 菌种的 16S rDNA 基因序列同源性为 99.37%，h 与 Pseudomonas koreensis 的序列同源性达 99.44%。c-1 菌株与系统发育最近的 Peribacillus frigoritolerans 菌种的 16S rDNA 基因序列同源性为 99.52%。d 菌株与系统发育最近的 Microbacterium foliorum 菌种的 16S rDNA 基因序列同源性为 99.44%。菌株 j 与系统发育最近的 Niallia circulans 菌种的 16S rDNA 基因序列同源相似性达 99.72%。菌株 z 与系统发育最近的 Bacillus mobilis 菌种的 16S rDNA 基因序列同源性达 99.65%。结合菌株 a-1、h、c-1、d、j 和 z 的菌落形态、功能特性、生理生化特性等，鉴定菌株 a-1 和 h 均为假单胞菌属（Pseudomonas），菌株 c-1 为近芽孢杆菌属（Peribacillus），菌株 d 为微杆菌属 （Microbacterium），菌株 j 为尼尔菌属（Niallia）。菌株 z 为芽孢杆菌属（Bacillus）。
图9基于菌株的 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树
2.15 耐低温菌株促生试验
用筛选得到 3 株耐低温菌株的菌液处理白菜型冬油菜‘天油 4 号’种子，在 4℃下进行平皿促生试验 （图10）。从图10可以看出，与对照相比，耐低温菌株处理的种子生长状态相对较好，差异比较显著。从种子胚芽和胚根长度来看（表8），3 株耐低温菌均可不同程度地促进种子胚芽和胚根生长，其中，菌株 c-1 对白菜型冬油菜种子的促生效果最好，胚芽和胚根的长度增加幅度最大，依次增加了 27.68% 和 38.04%，其次为菌株 a-1，菌株 h 只有轻微的促生效果。
图10耐低温菌株 a-1、c-1、h 对白菜型冬油菜‘天油 4 号’种子萌发胚芽、胚根生长的影响
表8耐低温菌株对白菜型冬油菜‘天油 4 号’种子萌发胚芽、胚根生长的影响
3 讨论
PGPR 是一类生活在土壤或附着于植物根际的微生物，其可通过直接作用和间接作用促进植物生长、增加作物产量。PGPR 的直接作用包括通过溶磷、解钾、固氮作用调节养分利用率，分泌生长素、ACC 脱氨酶、赤霉素等生长调节物质促进作物发育，其间接作用可通过招募有益微生物、抑制病原菌、改良土壤等间接作用促进作物生长[34-35]。刘晔等[36]从花生根际筛选出一株优势芽孢杆菌 HS9，具有优良的溶磷、解钾、固氮、产生长素能力，且对花生具良好的促生作用；刘悦等[37]从大豆根际土壤中分离获得 29 株优良菌株，具解磷、固氮、解钾、产生长素、产赤霉素能力，其中有 7 株有望作为大豆微生物肥料。本试验从白菜型冬油菜根际土壤中筛选得到 7 株细菌，其中菌株 c 具有解钾、产淀粉酶能力，其产纤维素酶能力最好，D/d 值达 3.29，对 NaCl 的耐受程度高达 10%；菌株 d 具产淀粉酶能力，耐盐程度可达 8% NaCl；菌株 j 具解钾、产淀粉酶功能，其产果胶酶效果最优，D/d 值为 3.23；菌株 z 可产纤维素酶，其产淀粉酶能力最好，D/d 值高达 4.24，且耐干旱程度较高，在质量浓度为 25% 的 PEG-6000 胁迫 （水势为-0.73 MPa）下仍可生长。
低温是限制西北寒旱区作物生存和生长的重要环境因素，而耐低温细菌在寒冷环境下长期生存过程中形成了特殊的调控机制，能有效避免低温对作物的伤害，因此耐低温细菌具有独特的生理特性和潜在的应用价值。芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和假单胞菌属（Pseudomonas spp.）两大类土壤细菌在土壤和植物相互作用中发挥着关键作用[38]，王伟等[39]从不同省份 8 个作物根际土壤中分离筛选得到 8 株耐低温菌，可溶磷、产生长素、产嗜铁素等，选择 D4 和 R1 在低温下进行肥效试验，效果均优于普通肥料，经 16S rRNA 基因鉴定 2 株菌均为芽孢杆菌；已有研究者[40-42]从高寒草地作物根际分离出的耐低温菌株具固氮、解磷、产生长素、产铁载体等促生功能，且对不同作物有显著促生效果，其中假单胞菌属为优势菌属。河西走廊独特的地理环境和气候条件孕育了特殊的菌种资源，本试验从白菜型冬油菜根际土壤中筛选出 3 株耐低温菌株，菌株 a-1 和 h 为为假单胞菌属（Pseudomonas），菌株 c-1 为近芽孢杆菌属（Peribacillus），菌株 a-1 可溶磷、产铁载体、产蛋白酶，耐干旱能力强，对质量浓度为 25% 的 PEG-6000（水势为-0.73 MPa）胁迫仍具有耐受性；菌株 c-1 具解钾、产果胶酶、纤维素酶、淀粉酶能力，其产铁载体能力最强，D/d 值高达 3.43，可以耐受质量浓度为 8%的 NaCl 胁迫；菌株 h 能产铁载体，解钾能力最强，可达 217.16 mg/L，产蛋白酶效果最好，D/d 值为 2.55，对 PEG-6000 的耐受程度高达 25%。选用这 3 株耐低温菌株进行促生试验，结果表明 3 菌株均具促生作用，菌株 c-1 的促生效果最好，促进冷敏感白菜型冬油菜种子胚芽和胚根的长度依次增加了 27.68% 和 38.04%，菌株 a-1 次之。此结果与已有研究者的试验结果相符[40-42]，但菌株的低温促生效果方面还有待深入地研究。
4 结论
本研究从白菜型冬油菜根际土壤中筛选出菌株命名为 a-1、c、c-1、d、h、j 和 z，初步确定菌株 a-1 和 h 为假单胞菌属，菌株 c 无鉴定结果，菌株 c-1 为近芽孢杆菌属，菌株 d 为微杆菌属，菌株 j 为尼尔菌，菌株 z 为芽孢杆菌属。这 7 菌株兼具耐干旱、耐盐等抗逆性，解磷、解钾等促生特性，产果胶酶、纤维素酶等产酶特性以及生理生化特性中的两种或多种功能。耐低温菌株 a-1、c-1 和 h 均可不同程度地促进冷敏感白菜型冬油菜种子萌发，以菌株 c-1 促进效果最明显。本研究可为白菜型冬油菜耐低温微生物提供优良的菌种资源。
