摘要
为探究外源菌剂添加量对牛粪好氧堆肥中抗生素抗性基因的影响，将牛粪和高粱秸秆按体积比 7∶3 混合，并添加不同剂量的粉状商品菌剂（T1 ～ T4：添加量分别为混合堆体干质量的 0‰、0.5‰ 、5‰、50‰）进行堆肥，每个处理 3 个重复。研究不同添加量对堆体温度、发芽指数、抗生素抗性基因种类、丰度及相关性的影响。结果表明，堆肥过程中，最高温出现在 T2 处理，为 74℃。T3 处理高温期维持时间最长，为 10 d。 T3 处理黄瓜的发芽指数最高，为 133.82%。T1 处理检测出 76 个抗生素抗性基因（ARGs）亚类，4 个可移动基因元件（MGEs）亚类；T2 处理检测出 101 个 ARGs 亚类，5 个 MGEs 亚类；T3 处理检测出 79 个 ARGs 亚类， 5 个 MGEs 亚类；T4 处理检测出 96 个 ARGs 亚类，6 个 MGEs 亚类。与 T1 处理相比，T2 ～ T4 处理的 APH（6）-Id、 IS6100、IS1247、ErmF、floR、sul2、tetX、tnpA-3 丰度均存在不同程度的下降，下降幅度分别为 0.64% ～ 39.54%、 7.31% ～ 34.29%、51.08% ～ 78.27%、30.40% ～ 41.84%、60.73% ～ 81.23%、20.00% ～ 42.03%、29.70% ～ 57.99%、 5.46% ～ 31.38%，T3 处理下降幅度最大。相关性分析显示，菌剂添加量与 IncI1_repI1、ISEcp1、aadA2、 aadA17、sul1 间存在正相关关系，与 ErmF、floR、ISCR1 间存在负相关关系。IncI1_repI1 绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加而升高，ISEcp1、aadA2、sul1、ErmF、floR、ISCR1 绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加呈现先降低后升高的趋势，aadA17 绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加呈现先升高后降低再升高的趋势。IS6100 与 APH（6）-Id 和 qacF_H 间存在显著正相关关系，与 tnpA-3 存在极显著正相关关系。IS1247 与 sul2 和 tetX 间存在显著正相关关系，与 ErmF 和 floR 间存在极显著正相关关系。说明可移动基因元件 IS6100 和 IS1247 有可能是 ARGs 丰度增加的载体。上述结果表明，在牛粪堆肥过程中，添加外源菌剂能延长堆体高温时间，提升腐熟度，降低 APH（6）-Id、IS6100、IS1247、ErmF、floR、sul2、tetX、tnpA-3 的绝对定量丰度，以 T3 处理效果最佳。
Abstract
In order to investigate the effect of the amount of exogenous bactericide on antibiotic resistance genes in the aerobic compost of cow manure，the raw materials of the experiment were cow manure and sorghum straw，which were mixed according to the volume ratio of 7∶3，and different doses of powdered commercial bactericide（T1-T4：The added amounts were 0‰，0.5‰，5‰，50‰ of the dry mass of the mixed pile，respectively），and the compost was carried out with 3 replicates for each treatment. The effects of different dosage on temperature，germination index，species，abundance and correlation of antibiotic resistance genes were studied. The results showed that the highest temperature in the composting process was 74℃ in T2 treatment. The high temperature period lasted the longest in T3 treatment，which was 10 days. The germination index of cucumber in T3 treatment was the highest（133.82%）．76 subclasses of Antibiotic resistance genes （ARGs）and 4 subclasses of Mobile genetic elements（MGEs）were detected in T1 treatment；101 ARGs and 5 MGEs subclasses were detected in T2 treatment；79 ARGs subclasses and 5 MGEs subclasses were detected in T3 treatment； 96 ARGs subclasses and 6 MGEs subclasses were detected in T4 treatment. Compared with T1 treatment，the abundances of APH （6）-Id，IS6100，IS1247，ErmF，floR，sul2，tetX，tnpA-3 of T2-T4 treatment were all decreased to varying degrees， the decreasing range was 0.64%-39.54%，7.31%-34.29%，51.08%-78.27%，30.40%-41.84%，60.73%-81.23%， 20.00%-42.03%，29.70%-57.99%，5.46%-31.38%，respectively，and T3 treatment had the highest decreasing range. Correlation analysis showed that the dosage of bactericide was positively correlated with IncI1_repI1，ISEcp1，aadA2， aadA17 and sul1，and negatively correlated with ErmF，floR and ISCR1. The absolute quantitative abundance of IncI1_repI1 increased with the increase of bactericide addition，while the absolute quantitative abundance of ISEcp1，aadA2， sul1，ErmF，floR，ISCR1 showed a trend of decreasing first and then increasing with the increase of bactericide addition. The absolute quantitative abundance of aadA17 was increased first，then decreased and then increased with the increase of the dosage of bactericide. IS6100 had significant positive correlation with APH（6）-Id and qacF_H，and had extremely significant positive correlation with tnpA-3．IS1247 had significant positive correlation with sul2 and tetX，and had extreme significant positive correlation with ErmF and floR. These results suggested that the mobile gene elements IS6100 and IS1247 might be the vectors of increased ARGs abundance. The above results showed that the addition of exogenous bacterial agents could prolong the high temperature time of the pile，improve the degree of maturation，and reduce the absolute quantitative abundance of APH（6）-Id，IS6100，IS1247，ErmF，floR，sul2，tetX，tnpA-3，and T3 treatment had the best effect.
抗生素被广泛用于畜牧养殖业，然而，进入畜禽体内的抗生素仅少部分被吸收利用，绝大部分以原药或代谢产物形式随粪尿排出体外[1-3]，抗生素的选择性压力会诱导肠道微生物和环境微生物产生抗生素抗性基因（ARGs），导致畜禽粪污中残存大量的 ARGs。畜禽养殖环境中 ARGs 会通过吸附、迁移等途径传播扩散，还会通过各种农业活动污染其周边地表水、地下水、农田土壤等环境，扩大传播范围，增加 ARGs 污染风险[4-5]。
研究表明，好氧堆肥可在一定程度上促进畜禽粪污中 ARGs 的去除[6]，如通过好氧堆肥有效处理猪粪中 ARGs 的残留[7]，有效降低牛粪中四环素类抗生素的含量[8]，牛粪中可能存在的抗生素含量也会被大幅度降低甚至消失[9]。但在堆肥过程中，不同工艺、不同接种剂对 ARGs 的消除效果不同，单一好氧堆肥或厌氧消化处理工艺对畜禽粪便中 ARGs 的消减效果不佳，可通过投加接种剂、预处理粪便等方法强化其 ARGs 的消减效能[10]。添加微生物发酵剂是促进畜禽粪便堆肥中抗生素和 ARGs 去除的有效手段，添加微生物菌剂的堆肥腐熟效果较好[11-12]，可以提高堆肥中功能微生物数量，延长堆肥的高温期，有效促进堆体中有机物的分解和腐殖质的生成[13-14]。如接种枯草芽孢杆菌可使堆料对枯萎病病原菌产生抑制作用，加速物料腐解进程，且对生物毒性物质有降解作用[15]，枯草芽孢杆菌的添加降低了畜禽粪污中 32 个目标 ARGs 的丰度[16]。接种极端嗜热菌后的超高温堆肥可以高效去除抗生素、抗生素残留物及相关的 ARGs 和 MGEs[17]。在奶牛粪污异位发酵床中接种复合菌剂更有利于提高堆肥温度并延长高温持续时间，有利于去除粪污中大部分 ARGs，降低 ARGs 传播扩散风险[18]，更快地去除堆肥中四环素和土霉素的含量[19]。目前，国内外学者针对畜禽粪便堆肥中 ARGs 消除开展了大量的研究，但关于菌剂添加量对 ARGs 消除的影响及机制却鲜有报道。本研究采用抗生素抗性基因芯片技术，分析不同菌剂添加量对牛粪堆肥过程中 ARGs 的影响，以期对进一步优化堆肥工艺进而消除畜禽粪便中的 ARGs 提供理论与实践基础。
1 材料与方法
1.1 试验方案
试验所用牛粪收集于贵州省贵阳市花溪区某小型家庭养殖场，牛粪原始样品的 pH 为 8.17，有机质、全氮、全磷、全钾含量分别为 596.48、 22.40、6.54、12.82 g·kg-1，黄瓜发芽指数为 59.48% （表1）。所用高粱秸秆收集于贵州省农业科学院高粱试验基地。试验所用菌剂为粉状的有机物料腐熟剂，由湖北启明生物工程有限公司提供，有机物料腐熟剂中有效菌种主要由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和绿色木霉组成，有效活菌数≥ 2.0 亿·g-1。试验于 2023 年 5 月在贵州省农业科学院土壤肥料研究所实验大棚开展，牛粪和高粱秸秆按体积比 7∶3 混合后，每个处理按照菌剂接种比例，将粉状有机物料腐熟剂均匀洒在堆肥物料表面，人工翻覆 5～6 次，确保菌剂与物料均匀充分接触。堆肥物料初始含水量控制在 55%，将翻覆均匀的物料转移至 300 L 的堆肥箱（图1）中进行自然堆肥，依据“温不等时、时不等温”的原则人工翻堆。设置 4 个菌剂添加量处理，分别为混合堆体干质量的 0‰、0.5‰、5‰、50‰，分别用 T1、T2、 T3、T4 表示，每个处理 3 个重复，共计 12 个堆肥箱。
表1牛粪原始样品中理化指标和发芽指数
图1试验堆肥箱
1.2 样品采集
堆肥前采集 12 个堆体样品混合成一份样品，并检测样品的 ARGs 丰度（表2和表3）。堆肥结束后，在每个处理的上、中、下部位进行混合取样。一部分样品保存于 4℃冰箱，用于发芽指数等测定，一部分样品保存于-80℃，用于 ARGs 的检测。
如表2和表3所示，牛粪原始样品中共检测出 13 个大类的 ARGs：氨基糖苷类（Aminoglycoside antibiotic）、四环素类（Tetracycline antibiotic）、 MLSB、林可酰胺类（Multidrug）、二氨基嘧啶类 （Diaminopyrimidine antibiotic）、氯霉素类（Phenicol antibiotic）、β-内酰胺类（Beta-lactamase）、氟喹诺酮类（Fluoroquinolone antibiotic）、糖肽类 （Glycopeptide antibiotic）、插入类（Insertional）、磺胺类抗生素（Sulfonamide antibiotic）、肽类抗生素（Peptide antibiotic）、转座酶类（Transposase） 和 1 个大类的可移动基因元件（MGEs），共检测出 102 个 ARGs。含量较高的 10 种 ARGs 和 5 种 MGEs 绝对定量丰度如下：floR、sul2、aadA2、sul1、 qacF_H、aadA17、ErmF、tnpA-3、tetX、APH（6）-Id、IS6100、IS1247、ISEcp1、IncI1_repI1、ISCR1，绝对定量丰度分别为 312.22×107、268.25×107、 141.38×107、131.08×107、128.78×107、119.36×107、102.27×107、100.55×107、98.45×107、82.11× 107、154.46×107、44.74×107、17.40×107、5.83× 107、1.53×107 copies·g-1。
表2牛粪原始样品中抗生素抗性基因和可移动基因元件种类及数量
表3牛粪原始样品中含量较高的 10 种抗生素抗性基因和 5 种可移动基因元件丰度
1.3 测定项目
1.3.1 温度的测定
采用富纳德堆肥温度计，依据《畜禽粪便堆肥技术规范》（NY/T3442—2019）每天 9：00 对堆体进行温度检测，在堆体上、中、下 3 个部位插置温度计，待温度计读数稳定后读取，3 个部位平均温度作为当天堆体温度，并同时记录室内温度。
1.3.2 发芽指数的测定
发芽指数参照《有机肥》（NYT525—2021）附录 F 中种子发芽指数的测试方法进行测定[20]，称取试样（鲜样）10.00 g，置于 250 mL 锥形瓶中，将样品含水率折算后，按照固液比（质量 / 体积） 1∶10 加入相应质量的水，盖紧瓶盖后垂直固定于往复式水平振荡机上，调节频率 100 次·min-1，振幅不小于 40 mm，在 25℃下振荡浸提 1 h，取下静置 0.5 h 后，取上清液于预先安装好滤纸的过滤装置上过滤，收集过滤后的浸提液，摇匀后供分析用。在 9 cm 培养皿（南通市海锐实验器材有限公司提供）中放置 2 张定性滤纸（皎洁定性滤纸），其上均匀放入 10 粒大小基本一致、饱满的未包衣黄瓜和萝卜种子，种子萌发率均≥ 90%，加入供试样浸提液 10 mL，每个处理中每种待测种子设置 3 个重复，盖上培养皿盖，在（25±2）℃的培养箱中避光培养 48 h，统计发芽种子的粒数，并用游标卡尺逐一测量主根长。以水作对照，作为空白试验。
种子发芽指数（GI）计算公式如下：
(1)
式中，A1：有机肥料浸提液培养的种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比，单位为 %；A2：有机肥料浸提液培养的全部种子的平均根长数值，单位为 mm；B1：水培养的种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比，单位为 %；B2：水培养的全部种子的平均根长数值，单位为 mm。
1.3.3 样品 ARGs 和 MGEs 的测定
样品 ARGs 和 MGEs 的测定委托广州美格生物科技有限公司完成，主要采用朱永官团队[21]发明的高通量 qPCR 基因芯片，定量检测样品中共 144 种抗生素抗性基因。
（1）相对拷贝数计算，芯片检测 16S rRNA 基因和目标基因的相对拷贝数公式如下：
(2)
（2）目标基因相对定量计算，芯片检测目标基因的相对拷贝数公式如下：
(3)
式中，a 为 16S 相对拷贝数；b 为目标基因相对拷贝数。
（3）16S rRNA 绝对定量检测结果及计算，根据 Roche 仪器检测获得 16S rRNA 基因的绝对定量信息：每微升的 16S rRNA 基因拷贝数再除以 DNA 上机的浓度，得到每纳克 DNA 的 16S rRNA 基因拷贝数，再根据提取原始样品量及提取 DNA 总量换算得到每克原始样品的 16S rRNA 基因拷贝数。
(4)
式中，c 为 16S rRNA 绝对定量（copies·μL-1）； d 为 DNA 上机浓度（ng·μL-1）；m 为提取 DNA 总量 （μg）；n 为提取样本量（g）。
（4）目标基因绝对定量计算，目标基因绝对定量的计算根据公式：16S rRNA 相对定量 /16S rRNA 绝对定量 =目标基因相对定量 /目标基因绝对定量，换算获得目标基因的绝对定量信息，详情如下：
提取 DNA 样本下的绝对定量（每纳克提取 DNA 的拷贝数）：
(5)
提取原始样本下的绝对定量（每克提取原始样品的拷贝数）：
(6)
式中，a 为 16S 相对拷贝数；b 为目标基因相对拷贝数；c 为 16S 绝对定量（copies·μL-1）；d 为芯片 DNA 上机浓度（ng·μL-1）；m 为提取 DNA 总量（μg）； n 为提取原始样本量（g）。
1.4 数据处理与分析
试验数据与分析采用 Excel 2003 及 SPSS 17.0 进行，采用美格云平台进行操作分类单元（OTU）、相关性热图等制作和分析，采用 DPS 进行数据的统计分析，结果则采用最小显著差异法（LSD） 在 P<0.05 水平上进行显著性分析，制图采用 Origin 8.0。
2 结果与分析
2.1 牛粪好氧堆肥过程中的温度及发芽指数变化
4 个处理在堆肥过程中，温度变化如图2所示，所有处理均在堆肥第 1 d 温度迅速上升并进入高温期（>50℃），T1、T2、T4 处理的高温期均为 9 d，T3 处理的高温期为 10 d。T1～T4 处理的最高温分别为 71.0、74.0、73.0、73.5℃。T1～T4 处理大于 70.0℃的天数分别为 2、4、3、3 d。
图2牛粪堆肥过程中温度的变化
种子发芽指数是检验有机肥有无毒害的重要指标。根据目前有机肥料执行的推荐标准 NY/T525— 2021，当发芽指数值≥ 70% 时，可认为堆肥腐熟。堆肥结束后将各处理样品进行发芽指数的测定，结果如图3所示。T1～T4 处理的黄瓜发芽指数分别为 117.91、123.37、133.82、122.27%，所有处理均腐熟完全，其中 T3 处理的黄瓜发芽指数最高，与 T1 处理间差异显著。T2～T4 处理与 T1 处理相比，发芽指数分别提升了 4.63%、13.49% 和 3.70%，黄瓜的发芽指数呈现随着菌剂添加量先上升后降低的趋势。
2.2 牛粪好氧堆肥过程中 ARGs 的种类变化
利用 ARGs 芯片检测堆肥后样品中的基因数（图4），共检测出 14 个大类的抗生素抗性基因：氨基糖苷类（Aminoglycoside antibiotic）、四环素类（Tetracycline antibiotic）、MLSB、林可酰胺类（Multidrug）、二氨基嘧啶类（Diaminopyrimidine antibiotic）、氯霉素类（Phenicol antibiotic）、 β-内酰胺类（Beta-lactamase）、氟喹诺酮类 （Fluoroquinolone antibiotic）、糖肽类（Glycopeptide antibiotic）、磺胺类（Sulfonamide antibiotic）、插入类（Insertional）、肽类抗生素（Peptide antibiotic）、转座酶类（Transposase）、整合酶（Integrase）、质粒 （Plasmid）、（Plasmid-inc） 分类（Taxonomic） 和 1 个大类的 MGEs。其中，T1 处理检测出 76 个 ARGs 亚类，4 个 MGEs 亚类；T2 处理检测出 101 个 ARGs 亚类，5 个 MGEs 亚类；T3 处理检测出 79 个 ARGs 亚类，5 个 MGEs 亚类；T4 处理检测出 96 个 ARGs 亚类，6 个 MGEs 亚类。
图3黄瓜发芽指数的变化
注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
图4牛粪中的抗生素抗性基因种类变化
2.3 牛粪好氧堆肥过程中主要 ARGs 和 MGEs 绝对定量丰度变化
针对牛粪原始样品中含量较高的 10 种 ARGs [aadA17、aadA2、APH（6）-Id、ErmF、qacF_H、 floR、sul2、sul1、tetX、tnpA-3]和 5 种 MGEs（IS6100、 ISCR1、IncI1_repI1、IS1247、ISEcp1），分析菌剂添加量对其绝对定量丰度的影响（图5）。在堆肥结束后，各处理 ARGs 和 MGEs 绝对定量丰度如下：T1 处理的 aadA17、ISCR1、IncI1_repI1 未检测出，检测出的 ARGs 和 MGEs 中，sul2 绝对定量丰度最高，为 139.99×107 copies·g-1，ISEcp1 绝对定量丰度最低，为 1.97×107 copies·g-1。T2 处理的 sul2 绝对定量丰度最高，为 104.33×107 copies·g-1，ISCR1 绝对定量丰度最低，为 0.10×107 copies·g-1。T3 处理的 ISCR1 未检出，检测出的 ARGs 和 MGEs 中，sul2 绝对定量丰度最高，为 81.15×107 copies·g-1，IncI1_repI1 绝对定量丰度最低，为 0.59×107 copies·g-1。T4 处理的 sul2 绝对定量丰度最高，为 112×107 copies·g-1， ISCR1 绝对定量丰度最低，为 0.02×107 copies·g-1。
图5各处理间抗生素抗性基因绝对定量丰度
与 T1 处理相比，T2～T4 处理的 aadA17、ISCR1 和 IncI1_repI1 绝对定量丰度有所提升，提升幅度分别为 35.2%～57.03%、0.1%～0.02% 和 0.38%～1.34%。其余 ARGs 和 MGEs 均有不同程度的下降，其中， APH（6）-Id 下降幅度为 0.64%～39.54%，IS6100 下降幅度为 7.31%～34.29%，IS1247 下降幅度为 51.08%～78.27%，ErmF 下降幅度为 30.40%～41.84%， floR 下降幅度为 60.73%～81.23%，sul2 下降幅度为 20.00%～42.03%，tetX 下降幅度为 29.70%～57.99%， tnpA-3 下降幅度为 5.46%～31.38%。上述 ARGs 和 MGEs 中，T3 处理的下降幅度均为最高，说明 T3 处理的菌剂添加量在一定程度上有助于牛粪堆肥过程中 ARGs 丰度的消减。
2.4 菌剂添加量与主要 ARGs 和 MGEs 间的相关性分析
将菌剂添加量、10 种 ARGs 和 5 种 MGEs 间进行相关性分析，结果如表4所示，菌剂添加量与 IncI1_repI1、ISEcp1、aadA2、aadA17 和 sul1 间存在正相关关系，相关系数分别为 0.931、0.856、 0.852、0.698 和 0.630，与ErmF、floR、ISCR1 和 IS1247 间存在负相关关系，相关系数分别-0.219、-0.210、-0.178 和-0.128。IncI1_repI1 绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加而升高，ISEcp1、aadA2、 sul1、ErmF、floR、ISCR1 绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加呈现先降低后升高的趋势，aadA17绝对定量丰度随着菌剂添加量的增加呈现先升高后降低再升高的趋势。说明不同梯度的菌剂添加量影响堆肥中 ARGs 和 MGEs 的变化，但不同 ARGs 和 MGEs 对菌剂的响应不同。
进一步分析 ARGs 和 MGEs 间的相关性发现， IS6100 与 APH（6）-Id 和 qacF_H 间存在显著正相关关系，相关系数分别为 0.952 和 0.971，与 tnpA-3 存在极显著正相关关系，相关系数为 0.993，说明 MGEs IS6100 有可能是 APH（6）-Id、qacF_H 和 tnpA-3 丰度增加的载体。IS1247 与 sul2 和 tetX 间存在显著正相关关系，相关系数分别为 0.969 和 0.988，与 ErmF 和 floR 间存在极显著正相关关系，相关系数分别为 0.996 和 0.995。，说明 MGEs IS1247 有可能是 sul2、tetX、ErmF 和 floR 丰度增加的载体。
表4菌剂添加量与主要抗生素抗体基因和可移动基因元件间的相关性分析
注：** 代表在 0.01 水平上显著相关；* 代表在 0.05 水平上显著相关。
3 讨论
3.1 外源菌剂添加对牛粪好氧堆肥中的温度及发芽指数的影响
本研究在牛粪堆肥过程中添加不同量的外源菌剂，通过实验室常规检测，对温度和发芽指数进行测定，通过抗生素基因芯片技术对堆肥结束后的牛粪样品中的 ARGs 进行检测与分析。本试验使用的商品菌剂主要成分为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和绿色木霉。枯草芽孢杆菌和绿色木霉是堆肥腐解常用的有益菌群，在促进腐殖化进程方面有着不同的效果[22]，枯草芽孢杆菌菌剂能够显著抑制好氧堆肥温度的降低和成熟阶段的矿化，促进碳的腐殖化，提高堆肥中腐植酸的含量和堆肥产品的品质[23]，绿色木霉兼具的促生和生防功能现已被广泛应用于生物有机肥的制备中[24]。本研究结果表明，添加菌剂的处理高温期（>50℃）最高能达 10 d，最高温达 74℃，大于 70.0℃的天数最多为 4 d。这与 Hu 等[25]、陈鑫等[26]、赵欧亚等[27]的研究结果一致，畜禽粪便堆肥过程中接种功能性菌剂有利于增强微生物活性，加快了堆肥中有机物的分解，从而提高堆肥温度，延长堆肥高温期[19]。接种微生物菌剂能够显著提高堆肥温度，加快分解堆体内的有毒物质，快速获得满足 NY/T525—2021 要求的堆肥产品，提高种子发芽率[28-29]。本试验中，未添加菌剂的 T1 处理的黄瓜发芽指数最低，T3 处理的黄瓜发芽指数最高，黄瓜的发芽指数呈现随着菌剂添加量先上升后降低的趋势。这与张业怀等[30]的研究结果一致，投加菌剂处理的堆肥腐熟度比不投加高。这可能是枯草芽孢杆菌菌剂对大肠埃希菌和寄生虫卵具有杀灭作用，从而有助于提高牛粪堆肥产物的质量[31]。
3.2 外源菌剂添加对牛粪好氧堆肥中的抗生素抗性基因种类及丰度的影响
本研究利用 ARGs 芯片检测堆肥结束后的牛粪样品 ARGs 的基因数，其中 T1 处理检测出 76 个 ARGs 亚类，4 个 MGEs 亚类；T2 处理检测出 101 个 ARGs 亚类，5 个 MGEs 亚类；T3 处理检测出 79 个 ARGs 亚类，5 个 MGEs 亚类；T4 处理检测出 96 个 ARGs 亚类，6 个 MGEs 亚类。添加菌剂处理的基因数相较于 T1 处理增多，一方面可能是外源菌剂的添加诱发牛粪中的 ARGs 活性，另一方面可能是菌剂本身存在少许 ARGs。但进一步分析牛粪原始样品中含量较高的 10 种 ARGs[aadA17、aadA2、APH（6）-Id、ErmF、qacF_H、floR、sul2、sul1、 tetX、tnpA-3]和 5 种 MGEs（IS6100、ISCR1、 IncI1_repI1、IS1247、ISEcp1）的绝对定量丰度发现，与 T1 处理相比，T2～T4 处理的 APH（6）-Id 下降幅度为 0.64%～39.54%，IS6100 下降幅度为 7.31%～34.29%，IS1247 下降幅度为 51.08%～78.27%， ErmF 下降幅度为 30.40%～41.84%，floR 下降幅度为 60.73%～81.23%，sul2 下降幅度为 20.00%～42.03%， tetX 下降幅度为 29.70%～57.99%，tnpA-3 下降幅度为 5.46%～31.38%。且 T3 处理的下降幅度均为最高，说明 T3 处理的菌剂添加量在一定程度上有助于牛粪堆肥过程中 ARGs 丰度的消减。
有学者指出，高质量的接种菌剂降低了畜禽粪便堆肥 ARGs 的库容[32]。在奶牛畜禽粪便堆肥中，总 ARGs、tetW 和抵抗素风险减少，堆肥降低了抗生素抗性传播的某些潜力[33]。牛粪堆肥后，ARGs 浓度显著降低，尤其是四环素类、β-内酰胺类和喹诺酮类 ARGs[34]。在高温堆肥中，ARGs 被去除 92%，其中四环素抗性基因减少 97%。本试验的研究结果与前人研究结果一致，添加菌剂堆肥在一定程度上改变了牛粪中的抗生素抗性基因种类和丰度，T3 处理的 ARGs 去除率最高，说明菌剂添加量过多或过少对 ARGs 的去除存在一定的影响。
3.3 外源菌剂添加量与 ARGs 的相关性分析
本试验中，菌剂添加量与 IncI1_repI1、ISEcp1、 aadA2、aadA17、sul1 间存在正相关关系，IS6100 与 APH（6）-Id 和 qacF_H 间存在显著正相关关系，与 tnpA-3 存在极显著正相关关系。IS1247 与 sul2 和 tetX 间存在显著正相关关系，与 ErmF 和 floR 间存在极显著正相关关系。这与 Peng 等[35]的研究结果一致，不同 ARGs 之间或 ARGs 与 MGEs 之间存在较强的正相关性。Hu 等[36]也发现，富集的 β-内酰胺类抗性基因与整合酶 intI1 基因的相对丰度呈显著正相关。 Wang 等[37]的研究结果也显示，sul1、sul2、tetW 基因丰度与 MGEs（intl1、intl2）呈显著正相关，表明 ARGs 存在水平基因转移的风险。同时 Wang 等[38]研究指出，堆体堆肥中 ARGs 的富集主要与细菌群落有关，而高温堆肥中 ARGs 的去除则直接受到微生物菌群的影响。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉、黑曲霉和酵母菌的微生物接种比例有利于堆肥的碳素和氮素保留，碳组分主要受 NO3--N 的影响，与拟杆菌呈正相关[39]。后期可在本研究的基础上，深入研究养分、ARGs 与 MGEs 间变化的影响机制，进一步消减抗生素抗性基因的转移传播。
4 结论
在牛粪堆肥过程中，接种以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和绿色木霉为主要成分的外源菌剂会对堆肥进程、堆肥品质和牛粪中的 ARGs 与 MGEs 丰度产生影响，菌剂添加量、MGEs 均与 ARGs 存在相关关系。试验结果表明，添加外源菌剂能延长堆体高温时间，提升腐熟度，降低 APH （6）-Id、IS6100、IS1247、ErmF、floR、sul2、tetX、 tnpA-3 的绝对定量丰度，以 T3 处理效果最佳。