摘要
氮肥配施抑制剂是提升氮肥利用率减少温室气体排放的有效途径，已有研究表明，新型生物抑制剂 2- 环戊烯酮（CCO）具有抑制脲酶活性与硝化作用的双重效果。为了探究 CCO 的具体适宜施用条件，指导其在生产实践中的应用，开展了室内培养试验。采用潮棕壤，共设置 3 个处理：不施肥（CK）；单施尿素处理；添加施氮量的 0.5% CCO 处理；分别设置不同的培养温度、持水量、pH 与有机质含量，定期测定培养后脲酶抑制率和硝化抑制率的变化。结果表明，CCO 的脲酶抑制率随持水量和腐殖质添加量的升高而减弱，随温度和 pH 值的增加呈先升高后下降的趋势；CCO 的硝化抑制率峰值均出现在培养前期，且随着温度、含水量和腐殖质添加量的升高均有不同程度的下降，随 pH 升高表现出先升高后下降的趋势，在 pH 为 7.3 时达最大值（66.00%），在培养中后期，土壤 pH 对 CCO 硝化抑制持续时间影响较大，腐殖质的添加显著延长了其硝化抑制作用的有效时间。综合分析，CCO 的抑制效果在培养前期且土壤温度为 20 ～ 25℃，土壤持水量 40%，腐殖质添加量 250 mg·kg-1，pH 7.3 时作用效果最佳。该研究成果为 CCO 在实际应用中能够稳定、高效地发挥作用提供了重要的科学依据和数据支撑。
Abstract
Nitrogen fertilization with inhibitors is an effective way to enhance the utilization of nitrogen fertilizers to reduce greenhouse gas emissions，and it has been shown that the new bio-inhibitor 2-cyclopentenone（CCO）has the dual effect of inhibiting urease activity and nitrification. In order to investigate the specific suitable application conditions of CCO and guide its application in production practice，an indoor incubation experiment was carried out with aquic brown soil in this study. Three treatments were conducted，including no fertilization（CK），urea alone，and 0.5% CCO with nitrogen. Different soil temperatures，water contents，pH and organic matter contents were set up，and the changes of urease inhibition and nitrification inhibition were determined periodically after incubation. The results showed that the urease inhibition rate of CCO weakened with the increase of water content and humus addition，and showed a trend of increasing and then decreasing with the increase of temperature and pH. The peaks of nitrification inhibition rate of CCO all appeared in the early stage of incubation，and had different degrees of decline with the increase of temperature，water content and humus addition， and showed a trend of increasing and then decreasing with the increase of pH，the maximum value of 66.00% was reached at pH 7.3. Soil pH had a strong effect on the duration of nitrification inhibition of CCO，and humus addition significantly prolonged the effective time of its nitrification inhibition，and the addition of humus significantly prolonged the effective time of its nitrification inhibition. In summary，the inhibitory effect of CCO in this experiment was optimal in the early stage of incubation and at a soil temperature of 20-25℃，soil moisture content of 40%，humus addition of 250 mg·kg-1 ，and pH 7.3. The research results provided an important scientific basis and data support for CCO to play a stable and efficient role in practical applications.
氮是影响农作物品质与粮食总产量十分重要的营养元素，也是农田氮养分的主要来源。据国家统计局 2020 年统计，我国目前是世界上最大的氮肥生产国与消耗国。当前，氮存在大量施用与不规范管理现状，在为作物提供营养元素与提高产量的同时也为人类赖以生存的环境带来了诸多的问题。首先，我国目前大多地区的农作物，例如玉米、小麦、水稻等氮肥利用率仅为 30%～50%[1]，相比于发达国家较低。其中氮肥主要通过氨挥发、地表径流、气体排放以及淋溶等方式造成损失，已有研究发现，在某些条件下，农田的氨挥发能够达到施氮量的 40%～50%[2]；在农业生态系统中，有近 70% 的氮素会因为硝化作用与反硝化作用而损失掉[3]。其次，部分氮肥在施入土壤后，氮的有效时间仅为 50 d 左右，有效期短，难以满足农田作物在整个生长时期对氮素养分的需求[4]。因此，需要长期且大量施用氮肥来保证植物生长发育的需求，但因氮肥的过量投入导致了诸多的环境问题[5]，包括土壤酸化，土壤中的有毒物质会伴随着食物链传递，对人类的健康产生潜在的威胁[6]；土壤板结，长期的施用氮肥而不施用有机肥，导致土壤中有机质含量下降，土壤的水土保持能力与肥力下降，造成氮肥投入不断增加的恶性循环[7]；增加温室气体的排放，农业中所产生的温室气体占总温室气体排放的 16%，其中因氮肥所产生的温室气体占 50% 以上[8]。
氮肥与抑制剂配施是目前解决上述问题最有效且经济的手段之一[9-10]，抑制剂可分为硝化抑制剂和脲酶抑制剂[11]。脲酶抑制剂可抑制土壤中脲酶活性，进而延缓尿素的水解速度，降低铵态氮（NH4+-N）的挥发和硝化。硝化抑制剂是通过抑制硝化作用的第一步氨氧化过程来发挥其功效的，即可降低土壤中氨氧化细菌、氨氧化古菌及其所包含的氨单加氧酶的活性，进而阻碍 NH4+-N 向硝态氮（NO3--N）的转化，减少氮肥淋失。抑制剂可以提高氮素的利用率，减少氮的淋溶损失，同时可以减少 N2O 的排放[12]。土壤的温度、持水量、pH 和土壤中有机质的含量等都会对抑制剂的作用效果产生不同程度的影响[13-15]。研究表明，硝化抑制剂和脲酶抑制剂的作用效果不仅受自身理化性质和生物活性的影响，还会受土壤中酸碱度、水分状况、通气性以及尿素浓度等影响[16]；孙庆元等[17]研究发现，土壤脲酶活性与温度呈正相关关系，加入 N-（正丁基） 硫代磷酸三酰胺（NBPT）后脲酶活性随温度的变化差异不显著，且 NBPT 的抑制作用效果随温度的升高而增强；高珊等[18]研究发现，在土壤持水量 60% 的条件下施加硝化抑制剂 3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）和双氰胺（DCD），抑制肥料氮气态损失的效果显著优于土壤持水量 40% 条件下施用硝化抑制剂的效果；硝化抑制剂的抑制效果会随土壤有机质的升高而降低[19-20]，Aulakh 等[21]研究发现，新鲜的有机物会刺激土壤中的微生物活动，使得硝化抑制剂的分解速率加快，减弱了硝化抑制剂的作用效果；王小彬等[22]研究发现，在 NBPT、苯基磷酰二胺（PPD）和氢醌（HQ）3 种脲酶抑制剂中，NBPT 在碱性的土壤条件下施用效果较 PPD 与 HQ 更好，脲酶抑制剂的最佳用量会因土壤的环境条件而存在差异。
近年来，有些学者发现，某些植物的提取物也会影响硝化与反硝化的过程[23]，这些提取物有与抑制剂相似的效果，能够抑制硝化作用并提高氮肥的有效性[24]。2-环戊烯酮（CCO）是洋甘菊干花头的乙醇提取物，是一种具有脲酶与硝化双重抑制作用的新型植物源抑制剂，其作用机制是通过争夺相关酶的活性位点，使酶与底物的结合受阻，从而产生抑制作用[25]。已有研究结果表明，CCO 能够调控氮素的转化，抑制脲酶活性，提升氮肥的利用效率，调控尿素水解与氨氧化过程，其减少温室气体排放的效果要优于 NBPT、DCD 与尿素的混施[8]。同时作为新开发的植物源抑制剂，能够改善传统抑制剂易流失、作用时间短以及对环境存在潜在风险的问题[26]，同时能够提升抑制效率，节约施用成本，具有极大的发展潜力。然而，关于 CCO 的研发正处于初级阶段，目前关于 CCO 在何种土壤环境条件下的抑制作用效果表现最好尚不明确，在本研究中，通过室内的培养试验，采用潮棕壤，控制土壤中的温度、pH、含水量以及腐殖质添加量的条件下，探明 CCO 发挥最佳作用效果时的最适宜环境条件，以指导其在生产实践中的应用。
1 材料与方法
1.1 试验设计
供试土壤为潮棕壤，采自中国科学院辽宁沈阳农田生态系统国家野外科学观测研究站（43°31′ N，123°22′E），其基本理化性质如表1所示。氮添加量为 250 mg·kg-1。试验共设置 3 个处理：不施肥对照（CK）；单施尿素处理；添加施氮量的 0.5% CCO 处理（CCO）。对培养的温度设置 3 个水平，分别为 20、25、30℃，土壤水分含量设为田间持水量的 40%、60%、80%；对 pH 设置 4种处理水平，利用添加 CaCO3 的方法调节土壤 pH， CaCO3 添加量分别为设置土壤量的 0.1%（pH 6.3）、 0.25%（pH 7.3）、0.5%（pH 8.1）和 1%（pH 8.8）； 对腐植酸的添加量设置 3 种处理水平，通过添加腐殖质调节土壤有机质的量，腐殖质添加量设为 250、500、1000 mg·kg-1。各组重复 18 次，氮素添加量为 150 mg·kg-1，每盆装干土 0.5 kg。每日对所有试验样品称重，对蒸发的水分用纯水进行补充，保持土壤水分含量不变。在试验开始前，将所有的肥料与抑制剂（包括其余添加物）全部施加于 0～10 cm 培养土层，采用破坏性取样的方式，每次选择 3 盆进行取样，每盆取 25 g 土样。
表1培养试验土壤理化性质
1.2 样品采集分析
在培养试验开始后分别于 1、4、7、14、28、 42 d 的 9：00—12：00 取样，并立即测定土壤中的 NH4+-N、NO3--N 的含量和 pH 值。测定方法：采用 50 mL 2 mol·L-1 KCL 浸提 5 g 鲜土，在 25℃条件下 160 r·min-1 振荡 1 h 后采用滤纸过滤，过滤液置于-20℃冰箱中等待测定。采用 AA3 连续流动分析仪，在波长 660 和 540 nm 条件下分别对土壤 NH4+-N 和 NO3--N 的含量进行测定。pH 值的测定采用梅特勒-托利多 SevenCompact S220 型 pH 计测定。
脲酶抑制率计算公式：
(1)
式中，A 为不添加抑制剂处理的土壤培养前后 NH4+-N 的含量差（mg·kg-1），B 为添加抑制剂处理的土壤培养前后 NH4+-N 的含量差（mg·kg-1）。
硝化抑制率计算公式：
(2)
式中，A 为不添加抑制剂处理的土壤培养前后 NO3--N 的含量差（mg·kg-1），B 为添加抑制剂处理的土壤培养前后 NO3--N 的含量差（mg·kg-1）。
1.3 统计分析
数据处理利用 Excel 2016 进行，统计分析采用 SPSS 22.0 进行，绘图采用 Origin 2021，采用 Oneway ANOVA 在 0.05 显著性水平的 Duncan 法进行评价。
2 结果与分析
2.1 不同处理下铵态氮的含量变化
CCO 处理的NH4+-N 含量随培养时间的增加呈现先上升后下降的趋势，NH4+-N 的含量在培养第 4 d、培养温度 20℃时最高（图1），为 67.94 mg·kg-1；不同持水量与腐殖质添加量处理的 NH4+-N 含量均随培养时间的增加呈现先下降后上升再下降的趋势，且在培养第 1 d、土壤持水量为 40% 时和腐殖质添加量为 1000 mg·kg-1 时最高，分别为 108.3 和 139.46 mg·kg-1；不同 pH 处理的 NH4+-N 含量在 pH 6.3 和 8.8 处理下整体呈下降趋势，pH 7.3 和 8.1 处理在培养中后期呈先上升后下降的趋势，在培养第 1 d、pH 8.8 处理下含量最高，为 201.21 mg·kg-1。
图1不同土壤环境条件下不同处理铵态氨含量变化
注：20、25、30℃表示土壤培养环境温度分别为 20、25、30℃；40%、60%、80% 表示土壤水分含量分别为田间持水量的 40%、60%、80%；250、 500、1000 mg·kg-1 表示土壤腐殖质添加量分别为 250、500、1000 mg·kg-1。下同。
2.2 不同处理下硝态氮的含量变化
土壤中 NO3--N 的含量随培养时间的增加整体呈现逐步上升的趋势，在土壤温度 25℃下 NO3--N 的含量整体较高（图2），且在培养后期达到峰值 （229.22 mg·kg-1）；在土壤水分含量处理中，NO3--N 含量呈现先上升后下降的趋势，在培养前期第 4 d 时达到峰值，土壤持水量为 80% 处理显著低于持水量 40% 与 60% 的处理，在培养中后期初步趋于平稳；在添加腐殖质的处理中，NO3--N 含量呈先上升后下降的趋势，在培养中期第 7 d 时达到峰值，且添加量为 500 与 1000 mg·kg-1 的处理显著高于添加量为 250 mg·kg-1 的处理，在培养前后期添加量为 250 mg·kg-1 的处理显著高于添加量为 500 和 1000 mg·kg-1 的处理；不同 pH 处理中，NO3--N 的含量变化整体呈现先下降后上升的趋势，各 pH 处理之间含量的差异不显著。
图2在不同土壤环境条件下不同处理硝态氮含量变化
2.3 不同处理下 2-环戊烯酮的脲酶抑制效率
在不同的温度和不同 pH 处理下，CCO 的脲酶抑制率体现出，随温度与 pH 的升高呈先上升后下降的趋势（图3），在 25℃和 pH 7.3 处理时抑制效率最高，分别为 54.22% 和 66.00%；随持水量和腐殖质添加量的升高呈下降的趋势，在土壤持水量为 40% 时最高，在腐殖质添加量为 250 mg·kg-1 时最高，分别为 50.53% 和 30.94%。整体上，添加腐殖质的处理脲酶抑制率显著低于其他处理，相较于温度、持水量与 pH 处理分别下降了 42.94%、 53.12% 和 38.77%，且各处理之间差异显著 （P<0.05）。
2.4 不同处理下 2-环戊烯酮的硝化抑制率
由图4a可知，不同的土壤温度条件下，CCO在 20℃下硝化抑制率的表现显著高于 25 和 30℃ 的处理（P<0.05）。各处理硝化抑制率在培养前期 （14 d 前）呈先下降后上升再下降的趋势，在培养至 7 d 时均达到峰值，土壤温度 20℃时硝化抑制率为 55.65%，当温度提升至 25 与 30℃时分别为 45.69% 和 28.53%，分别降低了 17.90% 和 48.73%。此外，硝化抑制率在培养中期（28 d）再次升高，土壤温度为 20℃时为 45.59%，当土壤温度提升至 25 和 30℃时分别为 31.49% 和 19.99%，在培养后期逐渐降低。
由图4b可知，整体上 CCO 在持水量不变的情况下受培养时间的影响较小。土壤持水量为 40% 的处理显著高于其他处理，且在培养前期（14 d 前）第 14 d 时达到峰值，当土壤持水量 40% 时为4 0.95%，当土壤持水量提升至 60% 和 80% 时分别为 33.36% 和 28.90%，分别降低了 18.53% 和 29.43%。在培养中期（28 d），土壤持水量 40% 的处理硝化抑制率为 37.60%，持水量提升至 60% 和 80% 时分别为 29.24% 和 19.99%，在培养后期 （42 d），土壤持水量 40% 的处理硝化抑制率为 36.58%，持水量提升至 60% 和 80% 时分别为 29.56% 和 19.44%。
图3不同土壤环境对 2-环戊烯酮脲酶抑制效率作用效果
由图4c可知，添加腐殖质的条件下，在培养前期（14 d 前）呈先上升后下降再上升的趋势，腐殖质添加量为 250 mg·kg-1 时在培养第4 d 达到峰值（32.10%），当添加量提升至 500 和 1000 mg·kg-1 时分别为 28.58% 和 15.65%，分别降低了 10.97% 和 51.24%。腐殖质添加量为 500 和 1000 mg·kg-1 的处理在培养前期第 14 d 时达到峰值，分别为 27.22% 和 28.25%。在培养中后期（14 d 以后）添加腐殖质的处理硝化抑制率均呈下降趋势，但随着腐殖质添加量的增加，能够显著提升 CCO 硝化抑制作用效果的持续时间，各处理之间差异显著（P<0.05）。
由图4d可知，不同 pH 处理下 CCO 的硝化抑制率峰值均出现在培养前期 1～4 d，pH 6.3 和 7.3 的处理显著高于 pH 8.1 和 8.8 处理，且在培养第 4～7 d 时有显著下降的趋势，在培养第 7 d 以后硝化抑制率较低且效果趋于平稳。pH 6.3 与 7.3 的处理在培养第 1 d 时达到峰值，分别为 65.89% 和 68.28%，pH 8.1 和 8.8 的处理在培养第 1 d 时硝化抑制率分别为 55.18% 和 47.25%，较 pH 7.3 处理分别下降了 19.19% 和 30.80%。
图4不同土壤环境对 2-环戊烯酮硝化抑制效率作用效果
3 讨论
3.1 环境温度对 CCO 抑制效果的影响
当土壤温度升高时，尿素的水解速率会因土壤中脲酶与尿素复合体的解离而提升。程冬冬等[27] 研究发现，其他条件相同的情况下，土壤脲酶活性在一定范围内会随温度的升高而增大，所以导致 25℃与 30℃处理下的 NH4+-N 含量显著高于 20℃ 处理，这与本研究结果一致。本研究中 CCO 的脲酶抑制作用呈现先升高后降低的趋势，最适温度是 25℃，其脲酶抑制作用机制与脲酶争夺活性位点，使得脲酶与底物的结合受阻，因此在本研究中，CCO 的脲酶抑制作用效果随着温度呈现的变化原因可能是随着温度的升高脲酶的合成数量增多，CCO 受投入量的限制，可能导致无法与新生成的脲酶结合从而起抑制作用，导致 CCO 的脲酶抑制作用效果随着温度的升高呈现先升高后下降的趋势[28]。再者，土壤温度与土壤生物的硝化作用密切相关，一般情况下，土壤最适宜的硝化作用温度范围为 25～35℃[29]，NO3--N 的含量也随着温度的升高呈现上升的趋势，这与本研究的结果一致。温度若过高且超出此范围，则会对硝化作用产生负面影响，在此适宜的范围内，土壤微生物的活性一般是随着土壤温度的升高而提升。CCO 作为生物大分子，其活性与土壤温度密切相关。本研究中 CCO 的硝化抑制效果随温度升高呈现下降趋势，可能是因为较高的温度可以提升土壤硝化抑制菌群的活性，分泌更多的硝化作用相关酶，因此，可以弥补因为抑制剂作用而失活的部分酶蛋白，而且温度的提升还可以提升酶的作用效率，缩短抑制剂的半减期[30]。较高的温度导致酶的数量增多，活性增强，在本试验中 CCO 的最适宜温度为 20℃，较硝化作用的最适温度更低。因此在以后大田的施用中，CCO 更适宜在 20～25℃的环境中，根据当地气温的变化规律调整 CCO 的投入量。
3.2 土壤中水含量对 CCO 抑制效果的影响
土壤的持水量可影响尿素的水解速率，通常土壤水含量较大时可使得酶的活性提升，从而促进尿素水解速率的提升[31]，因此本研究中，CCO 处理中 NH4+-N 的含量在土壤持水量 40%～60% 时呈现上升的趋势。前人的研究结果表明，降水量的增加可提高脲酶的活性，提升氮素的转化速率[32]。在本研究中，随着土壤水含量的增加，CCO 的脲酶抑制效果随之递减，这主要是由于土壤持水量的增加加速了可溶性有机质进入土壤，微生物可利用的底物增加，提升了尿素水解微生物活性，从而导致微生物向土壤中释放更多的酶，而 CCO 受制于数量原因，过量的酶超出了此数量 CCO 的作用极限，脲酶抑制率下降。水分是土壤中有关硝化微生物获得氧气难易程度的主要因素，土壤中硝化微生物不仅生长繁育受土壤水分的影响，而且其硝化作用效率受土壤通气性以及可溶性 O2 浓度的影响。本试验中，在培养前期，不同持水量处理中 NO3--N 含量先升高后降低再趋于平稳，培养前期土壤持水量为 40% 时，硝化作用抑制效果逐渐降低，持水量为 60% 和 80% 时硝化作用抑制效果逐渐升高。前人研究结果表明，在一定范围内土壤硝化作用强度与持水量呈正相关关系，最适宜硝化作用的持水量范围为田间持水量的 50%～70%[33]，本研究中，NO3--N 含量在培养前期土壤持水量为 60% 时最高，土壤持水量在超出此范围时硝化作用会受到不同程度的抑制。CCO 在培养前期的硝化抑制率也因土壤硝化菌活性的降低而随土壤持水量的提升显著降低，因为 CCO 本身溶解度小，所以在中后期受影响较小。因此，CCO 更适宜在持水量较低的土壤中施用。
3.3 土壤 pH 对 CCO 抑制效果的影响
土壤 pH 与脲酶抑制率也密切相关。土壤 pH 可直接影响酶的活性与作用速率，有些酶对于土壤 pH 的变化反应十分敏感，可在极小的范围内参与进行生化反应[31]。总体上说，硝化抑制剂的作用效果随 pH 的升高而降低，土壤适宜的硝化作用 pH 范围为 7～8.5[34]。在本试验中，CCO 在 pH 7.3 时脲酶和硝化抑制率表现最高，可能因为 CCO 具有抑菌作用，从而抵制了因 pH 增加而激发的微生物活性。此外，pH 可以通过影响土壤胶体性状，间接影响土壤对 CCO 的吸附与解析，pH 低时吸附量更大，因此，CCO 在偏中性的土壤中抑制作用效果更好。
3.4 土壤中腐殖质含量对 CCO 抑制效果的影响
向土壤中添加腐殖质可以增强腐殖质-酶复合体的数量与稳定性，从而提高土壤脲酶活性[35]，这与本研究的结果一致。前人研究结果表明，低浓度腐殖质对尿素水解速率并无显著影响，但是当腐殖质浓度较高时则能够显著影响尿素的水解速率，减弱尿素水解潜势[36]。在本研究中，随着腐殖质的增加，CCO 的脲酶抑制率呈现下降趋势，是由于腐植酸是一种有机高分子聚合物，具携带着多种活性功能团，如羟基、醌基、酚羟基等，能够与尿素竞争脲酶的活性位点，从而延缓脲酶-尿素复合体的形成与解离，降低脲酶活性，而脲酶活性越低则抑制剂的脲酶抑制率越低，所以土壤脲酶活性的降低能够导致脲酶抑制作用效果减弱。配施有机质也能够影响土壤硝化菌群的活性，可间接影响抑制剂的硝化作用效果[30]，其次，有机质对抑制剂有一定的吸附作用，可有助于抑制剂在土壤中的存留，减少其挥发，再者，有机质可以为土壤微生物提供氮源和碳源，促进微生物对抑制剂的降解。有机质的含量越高，菌群的活性越高，硝化速率越快。在本试验中，可能因为 CCO 具有抑菌效果，在培养的中后期抵消了有机质对土壤微生物活性的激发效应，此外，CCO 还可以通过巯基基团与有机质结合，从而避免降解，延长了抑制的有效时间。
4 结论
本研究表明，CCO 的脲酶抑制作用效果随持水量和腐殖质添加量的升高而减弱，随着温度和 pH 的增加而先升高后下降。其硝化作用抑制效率随着温度和土壤持水量的升高而降低，但在不同温度与持水量处理下均有较长的作用持续时间。这表明，其在偏中性的土壤中抑制作用效率表现最好，但抑制作用效果持续时间较短，而腐殖质的添加会对脲酶抑制率整体上有抑制效果。CCO 对硝化抑制作用效果的抑制主要表现在培养前期，但因 CCO 的抑菌特性在不同腐殖质的添加下能具有持久的效果。本试验结果表明，在土壤温度 20～25℃，土壤持水量 40%，pH 7.3 时 CCO 的抑制效果最佳，具有作为抑制剂的潜力。但是鉴于本试验的局限性，未来还需要更多的大田试验验证其在使用中的可用性与有效性，结合本研究明晰其在今后实际生产实践中的应用，以最优的方法应用于农业实践中。