摘要
园林废弃物堆肥是资源化利用的一种重要手段。在露天堆肥中，不同深度的氧化亚氮（N2O）排放是否有差异，其时间动态和影响因素如何并不清楚。据此，以广东省广州市绿化修剪枝条为材料进行堆肥，比较在堆肥不同时期，距离堆肥表面 0.2 m（表层）、0.6 m（中层）和 1.2 m（深层）N2O 排放浓度差异，进一步比较各层含水率、pH、电导率（EC）、铵态氮、硝态氮、种子发芽指数（GI）和细菌群落的差异。结果显示，随着发酵进程：（1）N2O 排放浓度有所升高，但层间差异不显著；（2）含水率、pH 和 GI 升高，EC 和硝态氮含量降低，这些指标的时间动态较层间差异更明显；（3）细菌多样性升高，第 36 d（中期）随层次增加细菌多样性降低；细菌群落以变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和拟杆菌门占优势。Rhodothermaeota 门和热孢菌门分别在堆肥中期（第 36 d）和后期（第 56 d）出现，指示微生物群落演替发生；（4）N2O 排放与理化指标之间的相关性为中层 > 表层 > 深层，以含水率、pH 和硝态氮为主导；第 3 d 和第 8 d N2O 排放和理化指标相关性较其他堆肥期更强，以 GI 和铵态氮为主导；（5）微生物与 N2O 排放的关系表现为第 36 d> 第 3 d> 第 56 d，装甲菌门在第 3 d、浮霉菌门和 Candidatus.Saccharibacteria 门在第 36 d 分别为影响 N2O 排放的主导类群。结果表明，堆肥过程 N2O 排放是伴随着微生物演替和丰度变化，受含水率、GI 和无机氮等多因素综合影响的结果。
Abstract
Composting of garden waste is an important mean of resource utilization. In open compost，it is not clear whether there are differences in the emission of nitrous oxide（N2O）at different depths，and how its temporal dynamics and influencing factors are. Based on this，green pruning branches of Guangzhou city were taken as materials and composted. The differences of N2O emission concentrations from the compost surface of 0.2 m（surface layer），0.6 m（middle layer）and 1.2 m（deep layer）were compared at different composting periods. Water content，pH，electrical conductivity（EC）， ammonium nitrogen，nitrate nitrogen，seed germination index（GI）and bacterial community of each layer were further compared. The results showed that with the fermentation process：（1）the emission concentration of N2O was increased， but it was not significant among the difference layers.（2）Water content，pH and GI were increased，but EC and nitrate nitrogen content were decreased，while the temporal dynamics of these indexes were more obvious than those of inter-layer differences.（3）The bacterial diversity was increased，but the bacterial diversity was decreased with the increase of compose layers on 36th d（middle stage）. The bacterial community was dominated by Proteobacteria，Actinomycetes，Firmicutes， Chloroflexi and Bacteroidetes. Rhodothermaeota and Thermotogae appeared in the middle stage（36th d）and the late stage （56th d）of composting，respectively，indicating the occurrence of microbial succession.（4）The correlation between N2O emission and physicochemical indexes was middle layer>surface layer>deep layer，while water content，pH and nitrate nitrogen were dominant. The correlation between N2O and physicochemical indexes on 3rd d and 8th d was stronger than that on other composting periods，while GI and ammonium nitrogen were dominant.（5）The relationship of microorganisms and N2O emission was performed as for 36th d>3rd d>56th d，while Armatimonadetes on 3rd d，Planctomycetes and Candidatus. Saccharibacteria on 36th d，respectively，were dominant groups affecting N2O emission. The results showed that N2O emission during the composting process was accompanied by microbial succession and changes of microbial abundances，and was influenced by water content，GI，inorganic nitrogen and other factors.
Keywords
随着国家森林城市的建设运行和城市绿化面积的提升，绿化植物自然生长更新中产生的枯枝落叶以及绿化养护过程产生的乔灌木 / 草坪修剪物等废弃物相应增加。这些“放错了位置的资源”间接促进了城市绿化废弃物堆肥产业的发展壮大。堆肥是园林废弃物资源化利用的一种有效手段。得益于技术的不断提升[1]，越来越多高品质的堆肥产品作为有机肥和育苗栽培基质等服务于农业和花卉产业[2-3]，实现资源的循环利用。
园林废弃物堆肥过程按温度变化一般分为升温阶段、高温阶段和降温阶段[4]，期间伴随着有机质分解、矿化和微生物代谢，并产生大量且种类复杂的气体；其中，氧化亚氮（N2O）作为堆肥原料氮素损失的代表[5]和具有较高增温潜势的温室气体[6-7]受到较广泛的关注。研究发现在园林废弃物堆肥过程中，N2O 排放造成的氮损失达堆肥原料总氮含量的 0.5%[8]，且 N2O 浓度显著高于环境本底值，甚至远超国家规定的相关环境气体浓度标准[9]。因此，在园林废弃物堆肥过程中，有必要将 N2O 的排放动态进行定期监测，在保证堆肥品质的前提下开展相关减排探究。
堆肥过程 N2O 排放是非生物因素和生物因素相互作用、共同驱动的结果。（1）非生物因素。影响堆肥过程中 N2O 和其他含氮气体产生和排放的因素较多，包括 pH、温度、含氧量以及堆肥原始物料的碳氮比等[9-11]。一方面，高温堆肥较传统堆肥具有更低硝态氮和亚硝态氮含量，并可降低约 90% 的 N2O 排放[12]；另一方面，堆肥体系电导率随堆肥进程以及园林废弃物类型而异[13-15]；种子发芽指数作为公认的评价堆肥腐熟度的指标之一[16]，对于堆肥品质把控必不可少。然而，在堆肥的不同时期，哪种非生物因素对 N2O 产生和排放有主导性影响尚未阐明。此外，在好氧堆肥过程中，随气体温度等和携带水汽量等的变化，堆体不同层次含水率等产生差异[17]，这是否引起其他堆肥物料指标以及 N2O 排放的分层化和差异化，目前在园林废弃物堆肥中尚未考虑到。（2）生物因素。在发酵过程中，微生物驱动有机质转化和稳定化[18]，在发酵过程中起关键作用。接种外源微生物菌剂一方面可有效活化微生物，促进木质纤维素等成分分解，加快腐熟[19]，另一方面可通过与化学添加剂联用协同减排 N2O 和 NH3 [20]，实现堆肥产品保氮。然而在堆肥不同层次，堆肥体系中微生物群落结构动态是否有差异，其对 N2O 排放的影响是否也具有层间差异鲜见报道。
本研究以广东省广州市绿化养护过程中产生的绿化废弃物为对象开展堆肥工作，以 N2O 排放动态监测为主线，比较堆肥不同进程和不同层次含水率、pH、电导率、铵态氮、硝态氮、种子发芽指数和微生物群落差异。通过综合分析，揭示影响园林绿化堆肥过程 N2O 排放的关键非生物因素和生物因素，为构建高效安全的园林绿化废弃物堆肥技术体系服务。
1 材料与方法
1.1 试验材料与设计
原始堆肥物料为广州市常规绿化管养过程中产生的绿化修剪物，主要为树枝，来源于棕榈科、桑科（多为垂叶榕 Ficus benjamina L.）和竹亚科植物。堆肥试验始于 2023 年 7 月 26 日，止于 2023 年 9 月 20 日，持续 56 d。将绿化废弃物收集后，集中在广州市城市绿色废弃物资源循环利用中心（广州市绿风生物技术有限公司生产基地）进行堆肥试验。为保证研究结果具有实际参考价值，堆肥体系和堆肥管理完全按照实际露天生产流程展开：试验堆肥体较生产用肥堆的尺寸进行了等比例缩小 （1∶4），总体积约 25 m3。将原始物料先后经过粗粉碎和细粉碎，粒径控制在 10～30 mm；分别准备 2.5 kg 菌种和 12.5 kg 尿素[即堆体体积（m3）∶ 菌种质量（kg）=10∶1，堆肥体积（m3）∶尿素质量 （kg）=2∶1]，保证堆肥物料碳氮比达到 25∶1。本研究采用的菌剂包括枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等优势菌群，含纤维素酶等多种活性物质[康源绿洲生物科技（北京）有限公司生产]。将菌种和尿素混匀后，采用人工抛洒的方式洒落于原始堆体上方，进一步采用履带式挖掘机用抓铲进行翻堆，将堆体和菌种、尿素进行充分混合。混合均匀后加水，将堆肥物料含水率调整到约 60%。初始堆肥体高度约 2 m，直径约 3 m。堆肥开始后定时翻堆，以促进堆肥内部的氧气流通和温度分布均匀。每隔 7～10 d，使用专用的翻堆机械将堆肥物料从底部翻至顶部，确保堆肥的各个部分都具备适宜的发酵条件。定期记录大气温度、湿度等参数以及堆体内部温度，实时监测堆体动态。
1.2 气体样品采集
分别在堆肥第 1、3、8、24、36 和 56 d 开展气体样品采集。将堆体由表及里依次分为表层、中层和深层，各层距肥堆表面垂直距离分别为 0.2、0.6 和 1.2 m。在每层的同一水平面上，按照 120°夹角设置 3 个气体采集点，取气方法为用连接有胶皮软管的 PVC 管（长 1.4 m，上做刻度标记表示表层、中层、深层取样深度）插入堆肥体中。胶皮软管上部连接一个 30 mL 注射器（注射器和胶皮管中间用胶水黏结密封；注射器上端连接两个三通）。PVC 管插入堆肥体中不同深度后，用 100 mL 注射器打开三通阀进行取气。每个采气点采集 3 次气体，采集后将气体样品及时转移到 0.25 L 预先抽好真空的气袋中。
1.3 堆肥样品采集
堆肥样品采集与采气在同一天进行，堆体分层同上。采气结束后，分别在各层取气位置用采样铲进行采样，样品置于封口袋中混匀，每层各获取 3 个重复样品。将封口袋清楚标注时间、地点、类型等，带回实验室分析。堆肥样品首先过 4 mm 标准筛，去除粗纤维和杂质；再过 2 mm 标准筛。过筛后的样品分成 3 份，第 1 份直接风干，用于测定 pH 和电导率；第 2 份保存在 4℃冰箱，一周内测定含水率、铵态氮、硝态氮以及种子发芽指数；第 3 份保存在-80℃冰箱，用于微生物群落分析。
1.4 检测项目及方法
堆肥温度由插入堆体中的呈 120°夹角排布的 3 个温度计实时监测；环境温湿度由实时记录的大气温湿度来指示；气体样品带回实验室后，用注射器转移到预先抽好真空的顶空玻璃瓶中，用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）分析 N2O 浓度； 堆肥样品 pH 和种子发芽指数测定方法参照《有机肥料》（NY/T525—2021），其中种子发芽指数采用黄瓜种子进行试验；采用烘干-称重法测定样品含水率，采用电极法测定电导率；新鲜堆肥样品用 2 mol·L-1 氯化钾溶液提取后过滤，用流动注射分析仪测定铵态氮和硝态氮含量。选取堆肥第 3 d、第 36 d 和第 56 d的堆肥样品分别作为堆肥初期、堆肥中期和堆肥后期的样品代表，进行微生物群落结构分析：参照 FastDNA® 试剂盒说明书提取样品总 DNA，对样品细菌基因组 DNA 的 16S V4 区域进行 PCR 扩增，构建细菌 16S 文库，由深圳海一时代基因科技有限公司完成测序分析。
1.5 数据统计分析
使用 SPSS 21.0 对研究数据进行单因素方差分析和差异显著性检验（P<0.05），比较各项指标在不同层次和不同堆肥时间的差异；进一步用 SPSS 21.0 分别对气体指标、理化指标和微生物指标进行 Pearson 相关分析和主成分分析（PCA）； 用 SigmaPlot 12.5 和 Excel 2021 进行制图。
2 结果与分析
2.1 堆肥过程中环境温湿度和堆体温度变化
如图1所示，堆肥期间大气温度和大气湿度分别为 24.0～34.0℃和 56%～99%。起堆发酵后，从第 0 d 到第 2 d，堆体温度迅速从 46.7℃跃升至 73.3℃并持续 4～5 d；从第 3 d 到第 25 d，堆体温度在 66.3～75.0℃区间波动变化，整体较稳定；第 26 d 至第 56 d，堆体温度呈波动式逐渐降低，于第 56 d 降至 58.7℃。
图1堆肥期间大气温度、大气湿度和堆体温度动态
注：图中显示为平均值 ± 标准误。
2.2 堆肥过程中 N2O 排放变化
如图2所示，随堆肥持续，N2O 排放浓度先略微降低后升高，第 8 d 表层和第 56 d 中层分别为最低（0.40±0.02）ppm 和最高（4.08±0.77）ppm。表层、中层和深层 N2O 排放浓度差异不显著，表层和深层随时间动态差异亦不显著（P>0.05）；中层第 8 d N2O 浓度较第 1 d、第 3 d 和第 24 d 有所降低，但差异不显著（P>0.05），但显著低于第 36 d 和第 56 d （P<0.05）。
图2堆肥过程中肥堆不同层次 N2O 排放浓度
注：不同小写字母表示同一时期不同层次间差异在 P<0.05 水平显著； 不同大写字母表示同一层次堆肥不同时期间差异在 P<0.05 水平显著。下同。
2.3 堆肥过程中理化指标和种子发芽指数变化
随堆肥持续，堆肥样品含水率整体呈先降低后升高的趋势（图3a）。从分层来看，除第 36 d 和第 56 d 外，含水率表现为表层最高，且在第 3 d 表层显著高于中层和深层（P<0.05）；中层和深层含水率在第 36 d 均显著高于第 1 d 和第 3 d（P<0.05），但与第 56 d 差异不显著（P>0.05）。
随堆肥持续，堆体 pH 上升，由中性向弱碱性变化（图3b）。从分层来看，除第 8 d 表层显著高于中层和深层外（P<0.05），各层次间 pH 差异不显著（P>0.05）；从分时间来看，3 个层次均表现为第 56 d 显著高于第 1 d、第 3 d 和第 8 d（P<0.05）。
电导率随堆肥进程先升高后降低，分别在第 3 d 和第 56 d 达到最高和最低（图3c）。电导率在层次间均无显著差异（P>0.05）；第 1 d 和第 56 d 中层电导率显著低于第 3 d、第 8 d、第 24 d 和第 56 d（P<0.05）。
随堆肥持续，铵态氮含量变化具有明显层间差异：表层整体降低，中层波动变化，深层先升高后降低（图3d）。从分层次来看，铵态氮含量在第 1 d 随层次加深显著降低，在第 3 d 随层次加深则表现为先降低后升高。从分时间来看，深层铵态氮时间动态不显著，表层第 56 d 较第 1 d 显著降低 （P<0.05），中层第 3 d 和第 56 d 铵态氮含量显著低于其他时间点（P<0.05）。
硝态氮含量随堆肥持续整体有降低趋势（图3e）。从分层次来看，第 1 d 和第 56 d 随层次加深硝态氮含量显著升高，第 8 d 则相反，硝态氮含量随层次加深显著降低（P<0.05）；从分时间来看，3 个层次时间动态均较明显：表层第 56 d 较其他时间点均显著降低；中层第 36 d 和第 56 d 较其他时间点均有显著降低；深层第 56 d 较第 1 d、第 3 d 和第 24 d 显著降低（P<0.05）。
随堆肥持续，种子发芽指数先略升高后稳定，在堆肥后期略有降低（图3f）。在第 56 d，表层、中层和深层种子发芽指数分别为 86.2%、92.3% 和 78.3%。除第 35 d、第 56 d，整个堆肥期间表层和中层种子发芽指数值均高于深层，但层次间差异不显著（P>0.05）；中层和深层种子发芽指数随时间变化也不显著（P>0.05）。
2.4 堆肥过程中细菌群落特征和动态变化
如图4a、b所示，从 27 个样本（3 个时间点 ×3 个层次 ×3 个重复）中共获得 2053161 条高质量细菌序列，平均每个样本 76043 条细菌序列。进一步分析发现，细菌群落 Shannon 指数和 Chao1 指数在第3 d 和第 56 d均表现为层次间差异不显著（P>0.05），在第 36 d表现为随层次加深而显著降低（P<0.05）。随堆肥持续，肥堆表层和中层细菌群落 Shannon 指数和 Chao1 指数呈先升高后降低的趋势，第 36 d较第3 d显著升高 （P<0.05）；但深层随堆肥持续呈升高的趋势，第 56 d Shannon 指数和 Chao1 指数显著高于第 3 d （P<0.05）。
如图4c所示，在细菌门水平，堆肥样品中丰度较高的前 5 个门依次为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。从分层来看：第 3 d 拟杆菌门、疣微菌门和芽单胞菌门相对丰度均表现为表层显著高于中层和深层（P<0.05），而放线菌门和厚壁菌门相对丰度由表层到深层有显著升高（P<0.05）；第 36 d，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度由表层到深层有显著降低（P<0.05）；第 56 d 除芽单胞菌门相对丰度随深度有显著降低（P<0.05）外，其他细菌门丰度在层次间无显著差异（P>0.05）。此外，不同于其他细菌门在 3 个时间点均有显示，堆肥第 3 d Rhodothermaeota 门相对丰度、堆肥第 3 d 和第 56 d 热孢菌门相对丰度均为 0（图4c）。从时间尺度看，表层变形菌门丰度随堆肥持续有所降低，第 56 d 显著低于第 3 d（P<0.05）；3 个层次的放线菌门丰度随堆肥持续而显著降低（P<0.05），而 3 个层次的绿弯菌门、浮霉菌门、疣微菌门和芽单胞菌门丰度则随堆肥时间增加有显著升高（P<0.05），中层和深层厚壁菌门丰度在第 36 d 和第 56 d 较第 3 d 显著降低（P<0.05）（图4c）。在细菌属水平中，相对丰度较高的前 4 个属为假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、Thermus 属和芽孢杆菌属（Bacillus）。其中表层假黄单胞菌属、鞘氨醇杆菌属和 Thermus 属相对丰度显著高于中层和深层，芽孢杆菌属相对丰度在堆肥第 3 d 显著高于第 36 d 和第 56 d（P<0.05） （图4d）。对比第 3 d、第 36 d 和第 56 d细菌属相对丰度发现，随堆肥时间增加，前 15 细菌属相对丰度均有降低趋势，其他种类细菌总相对丰度升高（图4d）。综上所述，堆肥内部细菌门类丰度随时间变异明显，前 5 优势细菌门的层次间差异也较明显，第 3 d 和第 56 d 层次间差异较第 36 d 明显。
图3堆肥过程中肥堆不同层次理化指标和种子发芽指数动态
图4堆肥不同时期肥堆细菌多样性和细菌门、细菌属相对丰度
注：a、b 为细菌多样性，c 为前 15 位细菌门相对丰度，d 为前 15 位细菌属相对丰度。D3S、D3M 和 D3D 分别表示第 3 d 表层、中层和深层；D36S、 D36M 和 D36D 分别表示第 36 d 表层、中层和深层；D56S、D56M 和 D56D 分别表示第 56 d 表层、中层和深层。
2.5 堆体理化指标与 N2O 排放相关性
如图5所示，表层 N2O 排放浓度与含水率之间、含水率与 pH 之间均有显著正相关关系（P<0.05），而 pH 与铵态氮和硝态氮之间、硝态氮与电导率之间均呈显著负相关关系（P<0.05） （图5a）；中层 N2O 排放浓度与含水率之间、含水率与 pH 之间有类似表层的显著正相关关系；N2O 排放浓度分别与 pH 和硝态氮呈显著正相关关系和负相关关系（P<0.05）；其他指标如含水率与硝态氮之间、硝态氮与 pH 之间有显著负相关关系（P<0.05） （图5b）；深层 N2O 排放浓度与其他指标无显著相关关系，含水率与 pH 之间、含水率与硝态氮之间、pH 与硝态氮之间相关关系类似中层，pH 与电导率之间呈显著负相关关系（P<0.05）（图5c）。对比不同堆肥时间点相关性发现，堆肥第 1 d pH 和种子发芽指数之间、铵态氮和硝态氮之间均呈显著负相关关系（P<0.05）；第 3 d pH 和发芽指数之间呈极显著正相关关系，并且 N2O 排放浓度与发芽指数和铵态氮之间分别呈显著负相关和显著正相关关系 （P<0.05）；第 8 d N2O 与发芽指数之间、发芽指数与铵态氮之间均呈显著负相关关系（P<0.05）；第 24 d 未发现各项指标之间有显著相关关系（P>0.05）； 第 36 d 和第 56 d分别只发现电导率与铵态氮之间、pH 与硝态氮之间呈显著正相关关系（P<0.05） （图5d）。
图5堆肥理化性质、种子发芽指数与 N2O 排放 Pearson 相关性示意图
注：a、b 和 c 分别为表层、中层和深层相关性结果，d 为堆肥不同时期相关性汇总（第 24 d 指标之间无显著相关性，图中未显示）；WC、EC、AN、 NN 和 GI 分别表示含水率、电导率、铵态氮、硝态氮和种子发芽指数。下同。双向箭头表示显著相关关系（实线箭头和虚线箭头分别表示显著正相关和显著负相关），不显著相关关系未显示；* 和 ** 分别表示相关性在 P<0.05 和 P<0.01 水平显著。
2.6 优势菌群丰度与理化指标和 N2O 排放相关性
主成分分析结果显示，在堆肥第 3 d，第 1 主成分（PC1）和第 2 主成分（PC2）共解释了 60.9% 的变异；硝态氮对 Rhodothermaeota 门丰度，pH 对芽单胞菌门、浮霉菌门和绿弯菌门丰度有显著影响，含水率与疣微菌门和 Deinococcus.Thermus 门丰度有显著影响，N2O 和发芽指数与装甲菌门丰度关系显著（图6a）；在堆肥第 36 d，PC1 和 PC2 共解释了 55.8% 的变异；铵态氮和含水率显著影响拟杆菌门、Deinococcus.Thermus 门和产水菌门丰度，硝态氮显著影响疣微菌门和芽单胞菌门丰度，而浮霉菌门和 Candidatus.Saccharibacteria 门丰度与 N2O 关系密切（图6b）；在堆肥第 56 d，PC1 和 PC2 共解释了 55.9% 的变异，铵态氮对热孢菌门丰度影响显著，硝态氮显著影响浮霉菌门和 Deinococcus.Thermus 门丰度，pH 对疣微菌门和酸杆菌门丰度，发芽指数对装甲菌门，电导率对拟杆菌门影响较为显著，N2O 排放与细菌门丰度关系不显著（图6c）。
图6堆肥体系中优势菌群丰度与理化指标和 N2O 排放主成分分析
注：a、b 和 c 分别为堆肥第 3 d、第 36 d 和第 56 d。
3 讨论
3.1 堆肥发酵期间 N2O 排放动态
堆肥过程 N2O 排放动态因发酵方式、堆肥物料种类和堆肥原始物料配比而异[10，19，21-22]。在本研究中，N2O 排放浓度随堆肥持续时间增加而升高 （图2）；这与 Hellebrand[8]以粪肥-草屑为原始物料堆肥过程中发现 N2O 在堆肥初期排放较高随后降低的趋势不一致，也与 Chen 等[23] 和 Yuan 等[10]发现 N2O 排放速率随堆肥持续有所降低不一致。究其原因可能是，本研究采取的堆肥方式为完全露天堆肥，除堆体内部环境外，还受外部环境如温湿度等动态变化的影响。另有研究表明，保持好氧环境有助于较低的 N2O 排放[8]；因此，中层较表层和深层更活跃的 N2O 排放（图2）可能归因于供氧状况：表层和深层分别偏好氧发酵和厌氧发酵，中层的氧气供应介于二者之间，可能更有利于 N2O 的产生和排放，但需对各层氮损失比例进行计算以验证。
3.2 影响 N2O 排放动态的非生物因素及其驱动因素
在农业和园林废弃物堆肥过程中，N2O 排放受诸多因素的影响，如有机碳、无机氮等[21，23]。有研究表明，在园林废弃物堆肥中，硝态氮是 N2O 产生的重要来源，反硝化过程较硝化过程对 N2O 排放具有更主导的贡献[24]。因此，对堆肥过程中铵态氮和硝态氮进行动态监测并与 N2O 排放浓度进行关系分析，有助于从氮素周转角度明确 N2O 的来源。本研究发现随着堆肥进程，铵态氮含量变化不显著而硝态氮含量有显著降低（图3d，e），中层硝态氮含量和 N2O 排放浓度之间有显著负相关关系 （图5b），且在堆肥中期和后期（第 24 d、第 36 d 和第 56 d），中层 N2O 排放浓度高于表层和深层（图2）。这些结果表明，在中层微生物对两种无机氮的利用具有偏好性，硝态氮转化更为明显，因此，反硝化是驱动 N2O 排放的主导路径，这在一定程度上支持了前人的研究[24]。堆体表层 N2O 排放浓度与含水率呈显著正相关关系（图5a），表明湿度增加有利于表层 N2O 排放；这与陈辉等[25]发现较高的含水率下 N2O 排放通量较大的结果不一致，可能是由于发酵方式差异：后者采用发酵桶发酵，湿度更易保持以利于厌氧过程 N2O 产生。园林废弃物堆肥中含水率与 N2O 及相关氮素转化过程的关系研究较为有限[19]，有必要对比不同含水率条件下堆肥 N2O 排放差异。深层 N2O 排放浓度与理化指标无明显相关关系 （图5c），表明深层 N2O 排放是多过程多因素复合影响的结果。
不同于发酵罐发酵[26]、花盆堆肥[27]或室内小规模堆肥发酵[28]，园林废弃物资源化利用实际生产中常采用露天式、条剁式堆肥，堆体体积较大且精细化管理较为有限。尽管会定期翻堆以保证氧气供应，不同层次微生物活跃程度差异依然带来温度、湿度等无机环境的分层化，其对 N2O 排放有无影响以及影响大小未见相关探究。本研究以此为出发点，比较 N2O 排放和其他理化指标的层间差异，发现表层 pH 和铵态氮分别通过直接和间接影响含水率而影响 N2O 排放，中层 pH 与 N2O 浓度呈直接正相关关系，深层 N2O 浓度与其他指标无直接相关性（图5）。推测除供氧差异外，不同层次环境差异通过影响 pH、无机氮和湿度等影响 N2O 排放。
园林废弃物堆肥进程不仅伴随含氮有机质的分解和 N2O 等的排放，还伴随着其他理化指标如无机氮、pH、电导率等的复杂变化[16，28]。电导率可反映堆肥物料中可溶性盐含量的变化[28]，是发酵进程的基本指标之一；种子发芽指数则是堆肥腐熟程度的指示指标之一[21]，种子发芽指数值 80% 被认为是判断发酵产品对作物生理毒性的分界线[29]，高于此值表明堆肥产品对作物的毒性基本消失，堆肥达到腐熟[21，30]。这些指标与 N2O 排放之间关系的动态变化如何未见系统探究。本研究对比堆肥不同时期发现，种子发芽指数与 N2O 排放之间关系最密切：第 3 d N2O 排放浓度与铵态氮和种子发芽指数分别呈显著正相关和显著负相关关系，第 8 d N2O 排放浓度与种子发芽指数、种子发芽指数与铵态氮之间均呈显著负相关关系（图5d）；而这两个时间点 N2O 排放浓度低于堆肥其他时间点 N2O 排放浓度，为排放低谷期（图2）。这两方面的结果暗示在堆肥初期（第 3 d 和第 8 d）：（1）铵态氮可能是 N2O 排放的关键限制因子；（2）种子发芽指数处于上升期，堆肥产品生理毒性降低且此阶段有利于 N2O 减排。随着堆肥进程，pH 和电导率分别有所升高和降低（图3b、c）；原因可能是，随着肥堆内部逐渐向弱碱性环境转化，微生物对堆肥物料中的含氮有机质不断分解造成一部分氮素以氨的形式损失[28]。两种指标对 N2O 均无直接影响（图5d），但 pH 在第 1 d 和第 3 d 与种子发芽指数之间均呈显著相关关系，电导率在第 36 d 与铵态氮显著相关，表明 pH 和电导率阶段性、间接性地影响 N2O 排放。
3.3 影响 N2O 排放动态的生物因素及其驱动因素
堆肥过程中微生物活动与堆体温度相互影响。在堆肥发酵初期，微生物参与分解有机物并释放热量；随堆肥持续，有机物因不断分解而减少，当微生物因周围养分不足以支持分解时，堆肥温度开始下降[13]。据此，一般按照温度变化将堆肥分为升温阶段、高温阶段和降温阶段。堆肥温度反映微生物参与分解有机物的活跃程度，是判断发酵过程和发酵腐熟情况最直观的参考指标之一[21，31]。在本研究中，发酵后肥堆快速升温，最高温度达 75℃ （图1），高于陈金峰等[28]报道的桉树皮堆肥发酵最高温度（55.2℃），可能归因于堆肥原始材料的差异；在堆肥第 56 d，肥堆中心温度依然较高 （58.7℃），既不同于胡永恒等[13]采用编织袋法对榉树 / 梧桐枝叶封口发酵和发现堆肥温度在后期基本降至环境温度，也高出陈金峰等[28]采用开放方式堆肥后期温度（约 40℃）。究其原因可能有 3 方面：首先是堆肥方式差异，本研究采用露天方式开展；其次是堆肥规模，陈金峰等[28]的肥堆只有 1 m3，远小于本研究的堆肥体积（约 25 m3），本研究的堆体内部热量发散更慢；最后为环境影响，堆肥期间大气状况不稳定，高温多雨，堆肥内部潮湿环境使得微生物较为活跃，发酵活动明显。
堆肥发酵伴随微生物群落的不断变化和演替，是多个微生物群体共同参与的动态过程[32-33]；接种外源菌剂被证明可以改变微生物群落演替规律，激发有效降解有机质的微生物群[34]。本研究采取添加外源菌剂形式对园林绿化修剪枝条进行堆肥，发现与堆肥初期（第 3 d）相比，堆肥中期（第 36 d） 和堆肥后期（第 56 d）细菌多样性增加（图4a、b），且变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和拟杆菌门为优势细菌门（图4c），与王志慧等[34]开展外源菌剂添加的棉花秸秆堆肥过程的微生物多样性动态变化和优势细菌群落基本一致。堆肥持续伴随着 3 个层次放线菌门相对丰度的显著降低以及绿弯菌门、浮霉菌门、疣微菌门和芽单胞菌门丰度的显著升高（图4c），表明主导发酵的优势微生物类群有所调整；值得一提的是，热孢菌门在堆肥第 56 d 出现，Rhodothermaeota 门在堆肥第 36 d 开始出现并持续到第 56 d（图4c），指示了细菌群落演替的发生；此外，与第 3 d 相比，第 36 d 和第 56 d 绿弯菌门相对丰度显著升高（图4c），同时第 36 d 和第 56 d 肥堆含水率亦显著高于第 3 d（图3a）；根据王秀红等[33]的研究推测，绿弯菌门作为一种兼性厌氧菌，受发酵物料含水率增加的影响，对应微生物种群开始增长并发挥作用。分层分析显示，第 3 d 表层拟杆菌门、疣微菌门和芽单胞菌门相对丰度高于中层和深层，第 36 d 变形菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度由表层到深层显著降低 （图4c），表明不同于理化指标（图3），微生物群落的分层差异更为明显。第 56 d 芽单胞菌门相对丰度随深度显著降低，但其他细菌门层次间差异不显著（图4c），表明在堆肥后期，芽单胞菌门作用更为突出，但微生物群落趋向均一化。随堆肥持续，细菌属多样性和相对丰度均呈现出降低趋势，且前 15 位丰度的细菌属总相对丰度逐步升高（图4d），进一步揭示随堆肥持续细菌群落演替的发生。
堆肥过程中微生物群落变化还受到理化因子如 pH 和有机碳等的驱动[34]，且添加微生物菌剂可提升堆体升温速度，延长高温持续期，并减少 N2O 和 CH4 等温室气体排放[4]。本研究采用 PCA 分析发现，堆肥中期（第 36 d）和堆肥初期（第 3 d） N2O 与微生物类群关系较堆肥后期（第 56 d）更密切（图6），表明从物料初期发酵发展到堆肥后期接近腐熟的过程中，微生物与 N2O 排放关系先增强后减弱；具体体现在堆肥第 3 d N2O 排放浓度与装甲菌门、第 36 d N2O 排放浓度与浮霉菌门和 Candidatus.Saccharibacteria 门之间的紧密关系，且这 3 个门的相对丰度以及 N2O 浓度均在堆肥第 36 d 天较第 3 d 有明显升高（图4c），表明装甲菌门在堆肥初期尽管种群较小，但贡献于初期 N2O 排放； 中期装甲菌门种群稍有扩大，但被丰度更占优势的浮霉菌门和 Candidatus.Saccharibacteria 替代主导影响 N2O 排放。此外，堆肥第 3 d 发芽指数与装甲菌门、硝态氮与 Rhodothermaeota 门、pH 与芽单胞菌门、含水率与疣微菌门和 Deinococcus.Thermus 门，堆肥第 36 d 硝态氮与疣微菌门和芽单胞菌门、铵态氮和含水率与拟杆菌门和 Deinococcus.Thermus 门之间的紧密关系也表明堆肥初期和中期理化性质变化对微生物群落具有重要驱动作用。堆肥第 56 d 尽管未看到 N2O 与具体微生物门类的紧密关系，铵态氮与热孢菌门、硝态氮与浮霉菌门和 Deinococcus.Thermus 门之间的紧密关系呈现出细菌群落变化与土壤理化指标变化的相互影响；有研究发现，Deinococcota 门中的 Thermus 类群既耐高温又普遍具有不完全反硝化功能[35]，那么，在堆肥后期 N2O 排放浓度最高（图2）可能是 Deinococcus. Thermus 门和其他多种微生物共同参与影响的结果； 需要后续深入探索反硝化功能微生物群落和 N2O 排放浓度关系以进一步验证。
4 结论
本研究以广州市园林绿化修剪树枝为原始物料并添加微生物菌剂进行露天堆肥，探究温室气体 N2O 排放的时间动态和层次间差异，并深究影响 N2O 排放动态的非生物因素和生物因素。随堆肥持续，N2O 排放浓度升高且以中层最为明显；但 N2O 排放在表层、中层和深层差异不显著。N2O 排放与理化指标之间的相关性表现为中层 >表层 >深层； 无机氮、含水率和种子发芽指数对 N2O 排放有直接影响，电导率对 N2O 排放的影响较弱。随堆肥持续，细菌群落多样性升高且在堆肥中期层间差异最为明显；Rhodothermaeota 门和热孢菌门分别在堆肥中期和后期出现，指示微生物群落演替发生。微生物与 N2O 排放的关系表现为堆肥中期（第 36 d）>堆肥初期（第 3 d）>堆肥后期（第 56 d）：装甲菌门在第 3 d、浮霉菌门和 Candidatus.Saccharibacteria 门在第 36 d 分别主导性地影响 N2O 排放。因此，不同时期和不同层次的 N2O 排放是伴随着堆肥进程微生物演替和丰度变化，受含水率、发芽指数和无机氮等因素主导影响的结果。