摘要
为探究秸秆不同还田深度配施腐熟剂对土壤微生物活化土壤磷素的作用机制，以黄棕壤发育的水稻土为研究对象，在模拟原土壤剖面中设置 0、10、20、30 cm 共 4 个秸秆还田深度（分别用 S0、S10、S20 和 S30 表示），并在不同还田深度设置秸秆还田 + 腐熟剂（S0+F、S10+F、S20+F、S30+F）处理，比较秸秆不同还田深度对微生物量碳（MBC）、微生物量磷（MBP）、磷酸酶活性、生物有效磷组分及编码 phoD 基因微生物的影响。结果表明，与 S20 和 S30 处理相比，S10 处理的 MBC、MBP 含量和酸性磷酸酶活性及生物有效磷组分均显著增加； 与 S10 处理相比，S10+F 处理的矿物结合态磷、有机酸易活化磷和磷酸酶易矿化有机磷含量增加了 8.5%～20.3%。同时，与 S30 相比，S10 处理的 phoD 基因拷贝数增加了 276.2%，在含 phoD 基因微生物群落组成的门水平上， S10 处理主要增加了放线菌门相对丰度；属水平上，S10 处理主要增加了假单胞菌属和中华根瘤菌属相对丰度。秸秆还田 10 cm 通过提高土壤 phoD 基因微生物丰度，增加土壤磷酸酶活性，进而提高土壤中生物有效磷组分，可作为最佳还田深度，且配施腐熟剂效果更好。
Abstract
To study the mechanism of straw incorporation at different depth with inoculants on the effectiveness of activating phosphorus by soil microorganisms，the paddy soil from yellow brown soil was collected and incubated in this experiment． Four straw incorporation depths were conducted：0，10，20 and 30 cm（S0，S10，S20 and S30），and straw returning+inoculant treatments were set up in different depths（S0+F，S10+F，S20+F，S30+F）to compare the effects of straw at different incorporation depths on microbial carbon（MBC），microbial phosphorus（MBP），phosphatase activities， bioactive phosphorus fractions and phoD gene functional microorganisms．Results showed that，comparing with S20 and S30 treatments，the MBC，MBP，acid phosphatase activity and bioactive phosphorus fractions content under S10 treatment were significantly higher．Compared with S10 treatment，the contents of mineral occluded，chelate-extractable phosphorus and enzyme extractable organic phosphorus were increased by 8.5%-20.3% under the S10+F treatment．The copy number of the phoD gene under S10 treatment increased by 276.2% compared to S30 treatment．At the phylum level of phoD genecontaining microbial community composition，S10 treatment mainly increased the relative abundance of Actinobacteria．At the genus level，S10 treatment primarily increased the relative abundance of Pseudomonas and Sinorhizobium．Incorporating straw at a depth of 10 cm could enhance soil phosphatase activity by increasing the abundance of phoD gene-containing microbes，which in turn boosted the content of biologically available phosphorus fractions in the soil．This depth should be considered optimal for straw incorporation to enhance soil phosphorus effectiveness，particularly when combined with an inoculant.
Keywords
磷对作物生长发育具有重要意义，是作物必需的大量营养元素之一[1]。而磷施入土壤后，经过一系列的化学、物理化学或生物化学过程，大多形成难溶磷酸盐，并迅速被土壤矿物吸附或被微生物固持，影响作物对磷的吸收[2]，因此提高磷有效性对作物生长起着关键作用。秸秆还田作为一种提高土壤磷有效性的方法，在改善土壤理化性质的同时，增加土壤有效磷含量，研究表明，与不还田相比，秸秆还田提高土壤有效磷含量 18.6%[3]。
近年来对秸秆还田促进土壤磷素有效性研究有了较大的发展，一方面是秸秆腐解可直接释放磷素、改善土壤理化性质，同时促进土壤难溶性磷酸盐溶解[4]；另一方面，秸秆中含有丰富的碳、氮、磷等营养物质，施入土壤能为微生物提供大量的外源碳和养分，促进微生物大量繁殖，有利于产生磷酸酶、低分子有机酸和 H+ 等，通过配位交换、H+ 活化和磷酸酶矿化等促进难利用磷的释放，增加土壤中酶溶液浸提的磷、柠檬酸溶液浸提的磷和盐酸溶液浸提的磷等含量[5]，可见，秸秆还田通过提高微生物活性，从而增加土壤磷素有效性。研究表明，秸秆还田通过改变水稻土中磷功能微生物基因丰度，促进土壤磷素转化[6]。在影响土壤磷转化的功能基因中，编码碱性磷酸酶的基因有 phoA、 phoD 和 phoX，宏基因组分析表明，phoD 基因的频率高于 phoA 和 phoX 基因，是最能代表土壤细菌群落的碱性磷酸酶编码基因[7]。这种酶在土壤有机磷矿化过程中发挥关键作用，能水解有机磷为有效磷[8]。Wang 等[9]还发现，秸秆还田可提高土壤 phoD 基因微生物丰度，进而增强碱性磷酸酶的活性，促进有机磷的矿化。然而，秸秆还田深度如何影响秸秆腐解、影响 phoD 微生物多样性、调控土壤各组分磷含量鲜见报道，且阐明其磷素生物有效性对明确秸秆还田方式及农业生产具有重要意义。
秸秆腐解程度是影响其还田后磷素释放的重要因素，麦逸辰等[10]研究发现，水稻秸秆腐解后磷释放率可达 60.3%；Gao 等[11]研究表明，添加复合菌剂能有效促进秸秆分解，加快秸秆腐解速率及养分释放，提高土壤有效磷含量；Song 等[12]发现，微生物在秸秆分解过程中起着至关重要的作用。秸秆腐熟剂富含高效微生物菌系，不仅能加速秸秆腐熟，还有助于释放磷素。但不同还田深度下，土壤微生物组成、通气性、理化性质存在显著差异，秸秆处理对提高土壤各组分磷素含量效果尚不明确，其影响机制需进一步探究。
本研究设置秸秆不同还田深度和添加腐熟剂处理，分析秸秆还田深度对微生物量碳（MBC）、微生物量磷（MBP）、磷酸酶活性和含 phoD 基因微生物群落组成的影响，探明其对含 phoD 基因微生物提高有效磷组分的作用机制，旨在为秸秆高效资源化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤和水稻秸秆均采自湖北省荆门市莲花村，土壤类型为马肝泥田。该地区年均气温 16℃，年均降水量 1000 mm。利用多点取样法分别取0～10、10～20、20～30、30～40 cm 土层土壤，自然风干后过 2 mm 筛，充分混匀备用，各层土壤基本理化性质如表1。秸秆于 105℃下烘 3 h 杀青，随后在 60℃下烘至恒重，磨碎，过 2 mm 筛备用。水稻秸秆基础养分含量和有机物组成：全磷 0.27%，全碳 36.41%，全氮 0.56%，碳氮比 65.02，纤维素 42.96%，半纤维素 26.90%，木质素 15.08%。腐熟剂是“沃宝”牌复合生物菌剂，富含酵母菌、丝状真菌、芽孢杆菌等菌株，腐熟剂用量占每个处理中供试土壤的 0.1%。
表1供试不同深度土壤理化性质
1.2 试验设计
将各层土壤按田间顺序装填在 PVC 管（高度 50 cm，直径 10 cm）中，每层土壤厚度为 10 cm，随后将 10.0 g 水稻秸秆装至 0.025 mm 尼龙网袋中，分别埋于 PVC 管中 0 cm（S0）、10 cm（S10）、20 cm（S20）、30 cm（S30）深度处（图1），设置添加 0.1% 腐熟剂（S0+F、S10+F、S20+F、S30+F） 处理，同时各个土层以不添加秸秆为对照，分别为 0 cm（No straw-0）、10 cm（No straw-10）、20 cm （No straw-20）、30 cm（No straw-30），腐熟剂添加深度和秸秆一致，一并放入尼龙袋中。共 12 个处理，每个处理重复 3 次，PVC 管中所有土壤重量为 4 kg。利用称重法每隔 3 d 补水 1 次，控制土壤湿度为田间持水量的 60%。培养试验在武汉华中农业大学温室内进行（温度为 23.2 ºC，光照为 300 lx），分别在培养的第 1、6、12 周采取破坏性取样，由上至下取不同深度的秸秆，冲洗，烘干，过 2.0 mm 筛备用；同时土壤样品取自秸秆上下 2 cm，土壤采集后一部分放置于 4 ºC 冰箱保存备用，另一部分风干，分别过 0.85、0.15 mm 筛备用。
图1不同处理示意图
1.3 样品采集与测定
1.3.1 基本理化性质测定
秸秆全磷采用 H2SO4-H2O2 消煮，电感耦合等离子体发射光谱仪测定；秸秆组成成分采用 Ringbio 全自动纤维分析仪测定[13]。
土壤 pH 采用电位法测定（水土比为 2.5∶1）； 有机质用 K2Cr2O7-H2SO4 外加热法测定；有效磷采用 0.5 mol/L NaHCO3 浸提-钼蓝比色法测定；速效钾采用 NH4OAc 浸提-火焰光度法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定。
1.3.2 微生物量碳和微生物量磷的测定
式中：Ec 为培养期间薰蒸土壤释放的 CO2 量与未薰蒸土壤培养期间释放的 CO2 量的差值，mg/kg；KEc 为转换系数，取值 0.45。
式中：Pi 为无机磷含量；KPi 表示加 KH2PO4 的土壤提取的 Pi，WPi 表示未熏蒸土壤提取的 Pi；EPi 为熏蒸土壤提取的 Pi 与未熏蒸土壤提取的差值；KP 为转化系数，取值 0.40。
1.3.3 酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的测定
称取过 0.85 mm 筛新鲜土样 1.0 g 置于 50 mL 容量瓶中，加入 0.25 mL 甲苯、4 mL MUB 缓冲液 [酸性磷酸酶（ACP）pH 6.5，碱性磷酸酶（ALP） pH 11]，同时加入 1 mL 用相同缓冲液配制的对硝基苯磷酸钠（ρNPP）溶液，加盖并摇匀，在 37℃ 下培养 1 h，然后加入 4 mL 0.5 mol/L CaCl2 溶液和 4 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液，充分反应后用滤膜过滤，400 nm 比色测定，同时做空白对照和用对硝基苯制成的标准曲线，每处理 3 次重复[16]。
1.3.4 生物有效磷分级测定（BBP 法）
称取 0.5 g 新鲜土壤于 50 mL 离心管中，分别加入 10 mL 提取剂（0.01 mol/L CaCl2、0.01 mol/L 柠檬酸、1 mol/L HCl 以及 0.02 mL ACP 和植酸酶试剂），充分混匀，置于往复振荡箱中室温振荡 3 h（180 r/ min），然后于 5000 r/min 离心 10 min，将浸提液过 0.45 μm 滤膜后测定磷含量。
原始酶提取液仅含 ACP 和植酸酶，为使有机磷组分更接近作物吸收过程，在原方法的基础上添加微生物来源的 ALP（Sigma P5931；Enzyme Commission Number 3.1.3.1），并在提取过程中以纯水代替醋酸钠缓冲液。植酸酶使用前于室温下透析 5 d，去除可水解磷。采用钼蓝法测定磷含量[17]，分别得到可溶性磷（CaCl2-P）、有机酸易活化磷 （Citrate-P）、磷酸酶易矿化的有机磷（Enzyme-P） 及矿物结合态磷（HCl-P）含量。
1.3.5 土壤微生物 DNA 提取和 phoD 基因实时荧光定量 PCR 测定
土壤 DNA 提取及功能基因测序由上海派森诺公司完成。使用 Fast DNA SPIN extraction kits（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）试剂盒提取培养 12 周的土壤微生物总 DNA，然后用 1% 的琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计（Nanodrop，PeqLab， Germany）分别对获得的土壤微生物总 DNA 进行定性与定量检测，检测 DNA 的浓度和纯度后储存于-20℃冰箱。
采用引物对 ALPS-F730：5′-CAGTGGGACGACCACGAGGT-3′和 ALPS-1101：5′-GAGG CCGATCGGCATGTCG-3′进行 phoD 基因 PCR 扩增，扩增体系为（15μL）：2×SYBRGreenMix（7.5 μL）、10 μmol/L 正向引物（1 μL）、10 μmol/L 反向引物（1 μL）、DNA 模板（1 μL）、加 ddH2O 补至 15 μL。扩增程序为：95℃、5 min 预变性，1 个循环；95℃、20 s， 55℃、20 s 和 72℃、40 s，40 个循环。引物扩增效率为 87.73%，R2 为 0.9955。
对含有 phoD 基因质粒进行 10 倍梯度稀释，制备标准品，并绘制标准曲线，计算样本中的基因拷贝数。
实时荧光定量 PCR 算法公式（绝对定量）：
式中，Ct 为循环阈值，b 和 k 分别为方程系数。
1.3.6 含 phoD 基因微生物群落 Illumina MiSeq 高通量测序
采用 Illumina 平台对群落 DNA 片段进行双端 （Paired-end）测序。首先用 cutadapt 切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列；用 Vsearch 软件的 fastq_mergepairs 模块拼接序列；用 fastq_filter 模块对拼接序列进行质控；用 derep_fulllength 模块去除重复序列；用 cluster_size 模块，在 98% 相似度对去重后的序列聚类，并用 uchime_denovo 模块去除嵌合体； 再用 perl 脚本（https：//github.com/ torognes/vsearch/wiki/VSEARCH-pipeline）过滤质控后序列集中的嵌合体，获得高质量序列；用 cluster_size 模块，在 97% 相似度对高质量序列聚类，并分别输出代表序列和操作分类单元（OTU）表。
在 70% 置信度下通过 RDP classifer 对 phoD 基因序列分类，产生不同分类水平（门、纲、目、科、属）下的各分类单元。基于分类学信息，使用 QIIME 1.9.1 中的 Alpha_Diversity.py 与 Beta_Diversity.py 脚本分析 α 多样性指数。通过 R 语言“Venn Diagram”分析样本共有、特有 OTU 韦恩图和不同菌种相对丰度。
1.4 数据统计与分析
试验数据由 Excel 2019、SPSS 21.0 进行处理，图表均由 Origin 18.0 制作。采用 Duncan 多重比较法（P<0.05）检验各指标平均值间差异显著性。
2 结果与分析
2.1 秸秆还田深度对土壤磷生物有效性的影响
2.1.1 微生物量碳、微生物量磷含量和微生物量碳 / 微生物量磷变化
如图2A 所示，培养 12 周后，与同深度不加秸秆相比，各土层秸秆还田均增加了 MBC 含量。其中，与 No straw-10 处理相比，S10、S10+F 处理的 MBC 含量分别增加了 227.4%、281.9%。另外， MBC 含量随秸秆还田深度增大而减少，与 S20 和 S30 相比，S10 处理下的 MBC 含量分别显著增加了 62.0%、393.0%（P<0.05），且与 S20+F 和 S30+F 相比，S10+F 处理下的 MBC 含量分别显著增加了 121.3%、232.5%（P<0.05）。
图2秸秆不同还田深度对微生物量碳含量（A）、微生物量磷含量（B）和微生物量碳 / 微生物量磷（C）的影响
注：图柱上不同的小写字母代表处理间差异显著（P<0.05）。下同。
秸秆还田显著增加了 MBP 含量（图2B），培养 12 周后，与同深度不加秸秆相比，各土层秸秆还田均增加了 MBC 含量。与 No straw-10 处理相比，S10、S10+F 处理 MBP 含量分别增加了 96.9%、 113.5%。就还田深度而言，MBP 含量随秸秆还田深度的变化趋势与 MBC 含量变化略有不同，其中 S10 处理的 MBP 含量最高。与 S0、S20 和 S30 相比，S10 处理下 MBP 含量分别显著增加了 84.2%、 31.3% 和 118.9%（P<0.05）；与 S0+F、S20+F 和 S30+F 相比，S10+F 处理的 MBP 含量分别增加了 104.6%、78.3% 和 112.8%。
MBC/MBP 是评估微生物代谢活性、秸秆分解效率及土壤养分平衡的关键指标。MBC/MBP 随秸秆还田深度、时间变化如图2C 所示。培养 12 周后，与同深度不加秸秆相比，S10、S10+F 处理的 MBC/MBP 分别增加了 68.7%、98.5%。另外，与 S20 和 S30 相比，S10 处理的 MBC/MBP 分别增加了 7.2%、140.6%，且与 S20+F 和 S30+F 相比，S10+F 处理下的 MBC/MBP 分别增加了 26.9%、 63.0%。
2.1.2 土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性变化
土壤中 ACP 活性随秸秆还田后培养时间延长先增加后减少（表2），在培养 6 周达到峰值。与同深度不加秸秆相比，各土层秸秆还田均增加了土壤 ACP 活性。其中，培养 6 周后，与 No straw-10 处理相比，S10、S10+F 处理 ACP 活性分别增加了 70.4%、72.3%。对于不同还田深度下，ACP 活性随秸秆还田深度增加而降低。与 S20 和 S30 相比， S10 处理下的 ACP 活性分别显著增加了 30.9%、 127.7%（P<0.05），且与 S20+F 和 S30+F 相比， S10+F 处理下的 ACP 活性分别显著增加了 85.1%、 204.4%（P<0.05）。
表2秸秆不同还田深度对酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响
注：表中数据为平均值 ± 标准差，不同的小写字母代表处理间差异显著（P<0.05）。
ALP 活性随秸秆还田后培养时间和还田深度的变化趋势与 ACP 活性一致，与 S20 和 S30 相比，S10 处理的 ALP 活性分别显著增加了 46.2%、 50.0%（P<0.05），且与 S20+F 和 S30+F 相比，S10+F 处理的 ALP 活性分别显著增加了 33.3%、69.8% （P<0.05）。
2.1.3 土壤有效磷组分含量变化
不同还田深度处理对各组分磷含量影响如图3所示，各组分磷含量存在较大差异，表现为 HCl-P>Citrate-P>Enzyme-P>CaCl2-P。培养 12 周后，与同深度不加秸秆相比，各土层秸秆还田处理的 HCl-P、Citrate-P、Enzyme-P 和 CaCl2-P 含量均增加。就还田深度而言，与 S10、S20 和 S30 相比，S0 处理的 CaCl2-P 含量分别显著增加了 59.9%、213.5% 和 468.7%；Citrate-P 含量分别增加了 40.6%、233.4% 和 1278.7%；HCl-P 含量分别显著增加了 57.5%、285.4% 和 1096.8%；Enzyme-P 含量分别显著增加了 147.9%、927.4% 和 4990.3%。另外，与 S20 和 S30 相比，S10 处理下的 CaCl2-P 含量分别显著增加了 96.1%、255.6%；Citrate-P 含量分别显著增加了 137.2%、880.8%；HCl-P 含量分别显著增加了 144.7%、660.0%；Enzyme-P 含量分别显著增加了 314.4%、1953.0%。
图3秸秆不同还田深度对有效磷分级各组分含量的影响
注：CaCl2-P、HCl-P、Citrate-P 和 Enzyme-P 分别表示可溶性磷、矿物结合态磷、有机酸易活化磷和磷酸酶易矿化的有机磷。
与 S20+F 和 S30+F 相比，S10+F 处理下的 CaCl2-P、Citrate-P、HCl-P、Enzyme-P 含量分别增加了 67.4% 和 70.8%、137.2% 和 1232.9%、316.5% 和 1549.2%、328.2% 和 724.7%。与 S10 处理相比， S10+F 处理的 HCl-P、Citrate-P 和 Enzyme-P 含量分别增加了 8.5%、11.9% 和 20.3%。
2.2 秸秆还田深度对土壤微生物的影响
2.2.1 土壤 phoD 基因丰度
如图4所示，与同深度不添加秸秆对比，添加秸秆处理的 phoD 基因拷贝数均增加。其中，与 No straw-10 处理相比，S10 处理的 phoD 基因拷贝数显著增加了 97.3%（P<0.05）。phoD 基因拷贝数随着秸秆还田深度增加而减少，S10、S10+F、S10 和 S10+F 的 phoD 基因拷贝数均值分别为 2.84×107、 2.01×107、0.75×107 和 2.03×107，与S30 相比， S10 处理下的 phoD 基因拷贝数增加了 276.2%。
2.2.2 土壤微生物群落组成
在 97% 相似度水平将高质量序列聚类成 OTU。如图5所示，与 No straw-10 处理相比，S10 和 S10+F 处理均增加了 OUT 数目。另外，与 30 cm 土层相比，10 cm 土层处理在两个深度下都显示出最大的共有区域，表明 10 cm 土层秸秆还田对微生物群落结构的影响较大，促进了更多共有类群的增加。
图4秸秆不同还田深度对 phoD 基因拷贝数的影响
图5秸秆不同还田深度处理下的 OTU 韦恩图
秸秆不同还田深度下微生物 OTU 数目和群落 α多样性指数如表3所示，与 No straw-10 处理相比，S10 处理的 OUT 数、Chao1 指数、Shannon 指数分别增加了 10.67%、10.03%、0.64%。对于不同土层而言，与 S30 相比，S10 处理的特有 OUT 数增加了 129.5%。另外，Chao1、Shannon、Pielou 指数均随秸秆还田深度增加而下降，而 Goods coverage 指数呈相反趋势。与 S30 相比，S10 处理的 Chao1、 Shannon、Pielou 指数分别增加了 228.6%、49.2%、 26.6%； 与 S30+F 相比，S10+F 处理的 Chao1、 Shannon、Pielou 指数分别增加了 53.5%、70.6%、 60.3%。
表3秸秆不同还田深度对 OTU 数目和α多样性指数的影响
含 phoD 基因微生物群落在门水平（a）和属水平（b）的组成结果如图6所示，S10 和 S30 处理的含 phoD 基因微生物的优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），相对丰度分别占 66.0%～96.5% 和 1.6%～10.9%，其中 S10 处理的放线菌门相对丰度占比高于 S30。
在属水平上，假单胞菌（Pseudomonas）、大豆根瘤菌（Bradyrhizobium）、中华根瘤菌（Sinorhizobium）、链霉菌（Streptomyces）为优势菌属，相对占比分别达到 11.6%、2.2%、1.4%、0.5%，其中假单胞菌为所鉴定出微生物属中主要属。与 S30 相比，S10 处理的假单胞菌和中华根瘤菌相对丰度较高；与 S30+F 相比，S10+F 处理的中华根瘤菌相对丰度较高。
图6秸秆不同还田深度下门水平（a）和属水平（b）上物种相对丰度
3 讨论
3.1 秸秆还田深度对土壤微生物促进磷有效性的影响
秸秆还田对提高土壤磷有效性至关重要，这与土壤微生物密切相关。研究表明，秸秆还田为微生物提供碳源，有利于微生物繁殖，微生物固持土壤中的碳供其自身生长需要，因此 MBC 是反映土壤微生物活性的重要指标[18]。本研究中，S0 处理下的 MBC 含量均高于 S10、S20 和 S30，这与土壤通气性有关[19]。已有研究表明，土壤孔隙控制微生物的活性与功能，对微生物群落组成有直接和间接的影响，在空间上直接控制微生物的移动，进而影响其群落间的相互作用，以及微生物群落组成和多样性；间接为微生物活动提供氧气和水分来影响其功能，所以土壤 MBC 含量与孔隙度呈显著正相关[20-21]。
不同的是，S10 处理下的 MBP 含量高于 S0、 S20 和 S30 处理。MBP 既是土壤磷循环与转化的 “中转站”，又是土壤磷生物肥力的主要贡献者，在植物磷生物有效性的再分配过程中发挥着关键作用，可以作为土壤活性磷库容量和周转强度的重要标志[22]。当土壤磷充足时，土壤微生物将更多的磷固持在自身生物量中，避免了磷固定和淋失，降低了农田生态系统磷的损失[21]，表明 S10 处理更有利于微生物对土壤磷素的固持。另外，MBP 是影响含 phoD 基因微生物群落结构的关键因子[23]，在土壤 MBP 周转过程中，微生物会同时释放无机磷和有机磷[24]。大部分无机磷通过革兰氏阴性溶磷细菌分泌有机酸、真菌分泌质子和菌根菌表达磷载体等途径变成有效磷，而有机磷则依靠含 phoC 和 phoD 基因的微生物分泌 ACP、ALP[25]和肌醇六磷酸酶等水解酶进行分解，形成有效磷[26]，有机磷的增加为酶促反应提供了更多的底物，该机制会进一步刺激编码磷酸酶的微生物形成[27]，即较高的 MBP 能刺激含 phoD 微生物群落形成。
本研究中，S10 处理的磷酸酶活性和 phoD 基因拷贝数均高于 S30，这是因为 phoD 以钙作为辅助因子[28]，而秸秆中含有氮、磷、钾、钙等营养元素，并且王辉等[29]发现 10 cm 深度还田处理的秸秆腐解率显著高于 30 cm，表明秸秆还田 10 cm 能释放养分更快，养分量更多，故可增加 phoD 基因拷贝数。对于含 phoD 基因的微生物而言，S10 处理下的生物多样性指数高于 S30，这是因为水稻土淹水下，土壤养分释放随着还田深度增加而减弱，养分有效性随还田深度而显著变化，微生物多样性也会降低[30]。研究表明，含 phoD 的优势细菌为放线菌门，蓝藻门，变形菌门等[31]，其中放线菌门在秸秆降解过程中起重要作用，可以产生有效降解有机碳的活性酶，加速秸秆腐解，其丰度与微生物分解作物秸秆的能力呈正相关[32]，在本研究中 S10 处理下的放线菌门相对占比高于 S30 处理，说明 S10 处理通过提高放线菌门的丰度促进秸秆降解，释放的养分反过来促进了放线菌门等含 phoD 的细菌的繁殖，形成了一个相互促进的良性循环，利于提高土壤磷的生物有效性。
综上，微生物在秸秆还田过程中促进磷素有效性起着十分关键的作用，然而土壤本身微生物状况会影响秸秆还田提高土壤磷素含量的效果，且土壤微生物状况又与土壤本身的性质和养分含量有关[33]。另外，秸秆不同还田深度促进磷素有效性还受到各土层中磷本身的限制。研究表明，土壤磷含量随有机质的增加而增加，但到了一定程度之后有效磷含量将不再增加[34]，表明秸秆还田对促进磷素有效性作用效果有限。这也解释了在本研究中，随着土壤深度的增加，各土层土壤本身磷含量逐渐降低（表1），当在不同土层均设置秸秆还田处理时，土壤有效磷组分含量表现为 S0>S10>S20>S30（图3）。查庆南等[35]也发现，在磷素水平较高的土壤中秸秆还田可加强土壤微生物对磷素的转化作用，降低土壤 MBC/MBP，增加 MBP 周转量，并缩短 MBP 周转期，更有利于土壤有效磷的提高。
3.2 秸秆还田配施腐熟剂对土壤微生物促进磷有效性的影响
秸秆腐熟剂中含有大量的活性微生物，可促进作物秸秆腐解，缩短养分转化时间并增加其释放量[36-37]。本研究中，S10+F 处理的 HCl-P、Citrate-P 和 Enzyme-P 均显著高于S10 处理，进一步证实了前人的结果[38]。本研究还发现，与 S10 处理相比，S10+F 处理的 HCl-P、Citrate-P、Enzyme-P 含量分别显著增加了 8.5%、11.9%、20.3%，phoD 基因拷贝数显著降低了 30.0%，这可能与 phoD 基因自身性质有关。缺磷会刺激土壤微生物参与磷转运、细胞壁合成以及利用磷酸酯、多磷酸盐的蛋白质的生物合成，即产生更多含 phoD 基因的微生物，在供磷条件下，则会抑制含 phoD 基因的微生物生长[39]。本研究中，腐熟剂的添加促进秸秆被快速腐解，其磷素大量释放，土壤供磷环境改善，导致含 phoD 基因的微生物相应减少，这与前人的研究结果一致[40]。
另外，S10+F 处理下的 phoD 基因拷贝数与 S30+F 处理相差不大，而 S10+F 处理的 ACP 和 ALP 活性却明显高于 S30+F 处理，这两处理均添加了腐熟剂，在秸秆腐熟后，其供微生物繁殖生长的养分相差不大，因此含 phoD 基因的生物数量也没有显著差异。对于 ACP 和 ALP 活性，Marklein 等[41]研究表明，氮可以增强土壤 ACP 和 ALP 活性，可能因为氮、磷循环广泛耦合，ACP 和 ALP 活性对氮、磷含量的变化高度敏感，S10+F 处理的养分释放率高于 S10 处理，随着土壤中氮含量升高，磷循环速度加快，从而使土壤中 ACP 和 ALP 活性增强。
4 结论
水稻秸秆 10 cm 还田比其他深度还田提高了土壤 MBC、MBP、ACP 活性及生物有效磷组分含量。同时，秸秆 10 cm 还田提高了 phoD 基因拷贝数，在门水平上提高了放线菌门相对丰度；在属水平上提高了假单胞菌和中华根瘤菌相对丰度。此外，在秸秆 10 cm 还田基础上添加腐熟剂可显著增加 Hcl-P、Citrate-P 和 Enzyme-P 含量。因此，秸秆还田 10 cm 深度可作为提高土壤磷有效性的最佳还田深度，且配施腐熟剂效果更好。