摘要
土壤微生物群落沿土壤深度发挥作用，了解土壤微生物群落剖面动态的信息对于预测喀斯特地区稻田土壤微生物群落长期在各土壤诊断层的活动具有重要价值。采用 16S rRNA 和 ITS 扩增子的高通量测序技术，研究了喀斯特地区稻田土壤深度的变化对土壤微生物群落的影响。结果表明：土壤深度的变化对土壤酶活性的影响较大，同时改变了细菌和真菌的群落组成和微生物多样性。共鉴定了 61 个细菌门和 18 个真菌门，土壤中占主导地位的细菌门是酸杆菌门（Acidobacteriota，相对丰度为 22.54%）、绿弯菌门（Chloroflexi，相对丰度为 16.67%）和变形菌门（Proteobacteria，相对丰度为 16.58%），其中底层土壤中富营养菌的相对丰度较低（变形菌门相对丰度从表层的 20.10% 降至底层的 16.04%），寡营养菌的相对丰度较高（酸杆菌门相对丰度从表层的 20.27% 增至底层的 26.88%）；优势真菌门包括子囊菌门（Ascomycota，相对丰度为 43.22%）和担子菌门（Basidiomycota，相对丰度为 21.04%）。碱解氮和磷酸酶是细菌群落的重要驱动因素（R2 分别为 0.5391 和 0.5085，P<0.001），蔗糖酶和有效磷是真菌群落的重要驱动因素（R2 分别为 0.2577 和 0.2032，P<0.05）。相较于真菌群落，细菌群落与环境因子的相关性更为显著。随着剖面深度的增加，理化指标呈下降趋势；土壤微生物多样性和共现网络随着剖面深度呈先下降后上升的趋势，表层土壤微生物网络包括 324 个节点和 754 条边，随着剖面深度呈下降趋势，而在底层土壤又上升至 79 个节点和 94 条边。本研究为喀斯特地区稻田土壤微生物群落随土壤深度变化提供新的见解。
Abstract
Soil microbial communities change along the soil depth，and information on the dynamics of soil microbial community profiles is valuable for predicting the long-term activities of soil microbial communities in rice fields in karst regions at various soil diagnostic layers. The effects of changes in soil depth on soil microbial communities in paddy fields in karst areas were investigated using high-throughput sequencing of 16S rRNA and ITS amplicons. The results indicated that changes in soil depth significantly affected soil enzyme activity and altered the composition and microbial diversity of bacterial and fungal communities. A total of 61 bacterial phyla and 18 fungal phyla were identified. The dominant bacterial phyla in the soil were Acidobacteriota（relative abundance of 22.54%），Chloroflexi（relative abundance of 16.67%），and Proteobacteria（relative abundance of 16.58%）. In deeper soil layers，the relative abundance of eutrophic bacteria was lower（Proteobacteria decreased from 20.10% in surface soil to 16.04% in deeper soil），while the relative abundance of oligotrophic bacteria was higher（Acidobacteriota increased from 20.27% in surface soil to 26.88% in deeper soil）. The dominant fungal phyla included Ascomycota（relative abundance of 43.22%）and Basidiomycota（relative abundance of 21.04%）. Alkali-hydrolyzable nitrogen and acid phosphatase enzyme were significant drivers of bacterial communities（R2 = 0.5391 and 0.5085，respectively，P<0.001），while sucrase and available phosphorus were key drivers of fungal communities（R2 =0.2577 and 0.2032，respectively，P<0.05）. Compared to fungal communities，bacterial communities showed a stronger correlation with environmental factors. As soil depth increased，physicochemical indicators exhibited a declining trend. Soil microbial diversity and co-occurrence networks initially decreased and then increased with soil depth. The surface soil microbial network comprised 324 nodes and 754 edges，showing a declining trend with depth，but increased again to 79 nodes and 94 edges in the deeper soil. This study provided new insights into the changes in soil microbial communities with soil depth in paddy fields in karst regions.
Keywords
成土作用的本质是一个协同过程，包括土壤中生物和非生物过程产生的固体物质的生产、选择、积累和分化，从而形成层次分明的土壤结构[1]。微生物参与多种农业生态系统过程，如固氮、植物与病原体相互作用、土壤稳定、有机物分解和生物地球化学循环，对农业生态系统至关重要[2]。即使在微生物死后，它们仍能通过不同的分解过程影响土壤的有机碳固存，因此一直是全球研究的重点[3]。
研究发现，来自同一剖面表层和底层土壤的细菌群落的样本，与来自相距数公里的相同层次样本相比，表现出更相似或更大的差异[4]。土壤深度代表了强烈的理化梯度，极大地影响土壤中的微生物[5]。微生物丰度随土壤深度的变化而显著变化[6]。土壤深度是影响微生物群落的最重要因素，但土壤有机质、土壤容重、深层土壤被水饱和的时间长度等土壤因素同样也是解释土壤微生物群落组成变化的重要变量[7]。因此，研究土壤剖面中的微生物群落组成、多样性、功能、驱动因素的分布格局及其与土壤理化性质的关系，对于理解土壤的形成和发育至关重要。
贵州位于中国西南部生态脆弱且敏感的喀斯特地区，水稻（Oryza sativa L.）是当地的重要作物[8]。土壤微生物是喀斯特陆地生态系统的重要组成部分，有关喀斯特地区土壤微生物群落的研究主要集中在表层土壤[9]。然而，它们对喀斯特地区稻田土壤剖面不同土壤诊断层的响应仍不清楚，为了探究喀斯特地区土壤物理化学性质、酶活性和微生物群落对土壤诊断层的响应，解析土壤微生物群落垂直空间分布规律。本研究从中国贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县采集 3 个不同的稻田剖面的42 个诊断层土壤样本，测定不同诊断层土壤物理化学性质、土壤酶活性、微生物群落，并结合生物信息学分析手段重点研究了细菌和真菌群落组成、多样性、共现网络和功能对土壤深度变化的响应。
1 材料与方法
1.1 研究区概况和土壤采样
研究区位于贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县（26°27′13″N，106°58′45″E），该地区是中国西南部典型的喀斯特地貌，属于亚热带季风湿润气候，年平均气温 15℃，海拔 1080～1500 m，耕作制度为一年两熟（图1a）。土壤母质是由第四系冰川沉积物和河流冲积物形成的，土壤的形成过程不同，形成了不同的障碍因子。选择 3 种具有不同障碍因子的稻田剖面，按照土壤诊断层次划分（图1b）。于 2024 年 4 月 3—12 日（ 温度 16～25℃） 在水稻田中收集土壤样本，共获得 3 个剖面的 42 个样本（表1）。土样充分混匀后用四分法取样，其中一部分土壤装无菌袋，在野外储存于冰盒 （4～10℃）中，运回实验室保存于-80℃超低温冰箱内，用于土壤微生物分析，另一部分土壤置于室内风干，研磨后用于土壤环境因子的测定。
图1稻田采样点和不同土壤诊断层的形态特征
注：Ap1、Ap2、Br、Bg 和 C 分别为耕作层、犁底层、氧化还原层、潜育层和母质层。
1.2 测定方法
使用土壤专用的 FastDNA® SPIN Kit for Soil 试剂盒提取所有土壤样本中的微生物基因组 DNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计和 1% 琼脂糖凝胶电泳评估 DNA 的纯度和数量。细菌 16S rRNA 基因的 V3～V4 区使用引物 338F 和 806R 扩增，真菌 ITS 基因的 ITS1 区使用引物 ITS1F 和 ITS2R 扩增。 PCR 系统（20 µL）包含 10 × 缓冲液（2 µL）、2.5 mmol/L dNTPs（2 µL）、5 μmol/L 正向引物（0.8 µL）、5 μmol/L 反向引物（0.8 µL）、Taq 聚合酶 （0.2 µL）、牛血清蛋白（0.2 µL）、模板 DNA（10 ng）和 ddH2O（添加至最终体积 20 µL）。扩增条件： 95℃、3 min，95℃、30 s（27 个细菌循环；35 个真菌循环），退火温度 30 s，72℃、45 s，72℃、10 min，10℃保存直至反应结束。PCR 扩增一式三份，然后将 PCR 产物按等摩尔比汇集，并通过 Illumina MiSeq 平台进行测序。
表1稻田土壤剖面形态
注：容重为均值 ± 标准误。同列不同字母表示同一剖面不同层次间差异显著（P<0.05），下同。① Ap1：耕作层；Ap2：犁底层；Br：氧化还原层；Bg：潜育层；C：母质层。② L：壤土；SL：砂壤土；CL：黏壤土。③ AB：角块状；MB：块状；G：颗粒状；C：碎屑状。
土壤含水量采用烘干法测定；土壤容重采用环刀法测定；土壤 pH 使用电位法测定；土壤有机质采用重铬酸钾-硫酸外加热法测定；土壤全氮采用凯氏定氮法测定；土壤全磷、全钾采用氢氧化钠熔融法测定；土壤碱解氮采用碱解扩散法测定；土壤有效磷采用钼锑抗比色法测定；土壤速效钾采用乙酸铵浸提-原子吸收法测定[10]。土壤酶活性按照试剂盒的说明书进行，脲酶以每天每克土样中产生 1 μg 的 NH3-N 定义为一个酶活性单位；土壤过氧化氢酶以每小时每克土样催化 1 μmol 过氧化氢降解定义为一个酶活性单位；蔗糖酶以每天每克土样中产生 1 mg 葡萄糖定义为一个酶活性单位；磷酸酶以每克土壤每小时水解对硝基苯酯产生 1 nmol 对硝基苯酚为一个酶活性单位，在磷酸酶活性测量期间，根据土壤 pH 使用酸性、中性或碱性试剂盒； N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以每小时每克土样中产生 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活性单位。
1.3 数据统计分析
扩增子测序原始数据由 QIIME2 Pipeline2020.2 处理，使用 DADA2 插件对清洗和修剪过的配对读数进行过滤和去噪处理，进而产生扩增子序列变体（ASV）。删除小于两个 reads 的 ASVs，然后使用 SILVA 数据库 138 和 Unite 数据库 8.0 分别对细菌和真菌进行分类学注释，置信度阈值为 70%。去除不属于土壤细菌和真菌群落的 ASV 后细菌和真菌分别获得 44410 和 6277 个 ASVs。
本研究利用 QIIME2 Pipeline2020.2 计算了微生物群落的多样性。通过美吉生物云平台 （https://cloud.majorbio.com）使用 FAPROTAX 和 PICRUSt2 分别对 16S rRNA 和 ITS 进行功能预测分析。利用 SPSS 25.0 完成数据单因素方差分析和 pearson 相关性分析，折线图使用 Prism 9.5.1绘制。聚类热图、韦恩图和堆积百分比图分别使用 R 3.3.1 中的 pheatmap、ggvenn 及 reshape2 包绘制。主坐标分析（PCoA）是使用 vegan 包中的 adonis 函数通过方差排列（PERMANOVA， 999 个列排），基于 bray-curtis 距离分析了土壤细菌和真菌群落的组成和结构的变化，并通过 R 3.3.1 中的 pairwiseAdonis 包确定不同土壤组之间微生物群落差异的显著性。基于消除趋势对应分析（DCA）分析结果中 Lengths of gradient 的第一轴大小选择冗余分析（RDA）进行分析，并使用 R 3.3.1 的 vegan 包完成可视化。通过 R 3.3.1 的 igraph 包计算节点、边等网络拓扑属性并利用 Gephi 进行可视化，最终得到共同网络图。
2 结果与分析
2.1 不同限制因子各层土壤理化性质和酶活性的变化
土壤深度对大多数理化指标产生了影响，pH 范围为 5.04～7.89，整体呈酸性至弱碱性，随着剖面深度的增加，土壤 pH 呈上升趋势，土壤有机质呈降低趋势（表2）。对于土壤中的全量元素，表层土壤全氮、全磷含量高于下层土壤，水稻土剖面的全钾含量范围为 3.02~11.98 g/kg。随着剖面深度的增加，土壤全钾的含量表现出底层大于表层的变化规律。土壤碱解氮与全氮有相同的趋势，土壤有效磷与全磷有相同的趋势，不同地块土壤速效钾趋势有所不同，除 LLQ 地块外，表现为表层土壤速效钾含量高于底层土壤（表2）。
表2不同稻田剖面土壤环境因子的单因素方差分析
注：表中数据均为平均值 ± 标准差。下同。
各样点表层的酶活性差异较大，例如脲酶活性范围为 275.63～624.65 μg/（d·g），磷酸酶活性范围在 1183.91～2944.48 nmol/（h·g），同性质土壤不同剖面层脲酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶在表层土壤中的酶活性最高，随着深度的增加而呈降低趋势，但蔗糖酶和过氧化氢酶含量并不随土壤深度表现出一定的趋势 （表3）。LLS 剖面的土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶活性随着剖面深度的增加呈下降趋势，过氧化氢酶活性表层土壤低于底层土壤。LLQ 剖面脲酶、磷酸酶和 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性耕作层明显高于其他诊断层，犁底层及以下的层次含量变化不明显，蔗糖酶和 β-葡萄糖苷酶活性不随剖面深度变化而变化，过氧化氢酶活性总体呈现先上升后下降的趋势。LLJ 剖面脲酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶活性随着剖面深度的增加呈下降趋势，蔗糖酶活性表层土壤低于底层土壤，过氧化氢酶活性则为中层土壤最低 （表3）。
表3不同稻田剖面土壤酶活性的单因素方差分析
2.2 土壤微生物群落的组成因土层深度而异
研究共鉴定了 61 个细菌门和 18 个真菌门，酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门 （Actinobacteriota）是稻田剖面土壤各个层次的主要优势菌门，占细菌门总相对丰度的 66% 以上（图2a）。酸杆菌门表现为底土层相对丰度大于表土层，LLJ4 较其他 3 层的相对丰度较少，LLQ3 相对丰度最低（12.06%），而 LLQ4 和 LLQ5 的相对丰度可以达到 LLQ3 的 2 至 3 倍，在 LLS 中则是表层土壤最少。蛋白细菌（Proteobacteria）在各剖面随着土层深度增加相对丰度呈下降趋势，在深层土壤中丰度增加。其他主要细菌门包括甲基肌酐菌门（Methylomirabilota）、硝化菌门（Nitrospirota） 和厚壁菌门（Firmicutes）（ 图2a）。在真菌门方面，子囊菌门（Ascomycota）（平均 40.22%）和担子菌门（Basidiomycota）（平均 21.04%）是主要的优势菌门，这两种优势真菌门占土壤真菌门总相对丰度的 60% 以上。子囊菌门和担子菌门在 LLJ 和 LLQ 都表现为底层土壤相对丰度高于表层土壤，而子囊菌门在 LLS 则表现为表层土壤相对丰度高于底层土壤，并且随着剖面深度增加，相对丰度逐渐减小；担子菌门在 LLS 则表现为表层土壤相对丰度低于底层土壤，并且随着剖面深度增加，相对丰度逐渐增加。其他真菌门是被孢霉门（Mortierellomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和脂霉菌门（Olpidiomycota） （图2c）。
不同层次土壤中有 530～5375 个细菌 ASV 和 54～668 个真菌 AVS，样本间 AVS 数目存在差异，且不同样本间共有的物种数量较少。细菌和真菌 AVS 均表现出以下趋势：表层 >中层 >底层 （LLQ5 除外）。其中，LLS1 土壤中细菌 AVS 数目最多，LLQ1 土壤中真菌 AVS 数目最多（分别为 5375 和 668 个）（图2b，d）。按照平均相对丰度 0.1% 的阈值进行划分，其中细菌稀有和丰富的门分别为 95 个（0.21%）和 44315 个（99.79%），真菌稀有和丰富的门分别为 166 个（2.64%）和 6111 个 （97.36%）。
2.3 不同土层深度的土壤微生物多样性差异
土壤细菌和真菌的 Ace 指数和 Sobs 指数都表现为表层最高，随着剖面深度的增加而呈下降趋势，但在 LLJ 和 LLQ 地块在最深层又有所增加，此外，本研究发现当土壤中细菌的 Ace 指数和 Sobs 指数发生变化时，真菌同样表现出相同的变化趋势（图3）。细菌的 Shannon 指数同样表现为表层最高，并随着剖面深度的增加呈现下降趋势（图3c），但真菌的 Shannon 指数并不随土壤剖面深度的变化而呈现一定的趋势（图3g）。使用基于 Bray-Curtis 距离算法的 PCoA 来表征不同土壤深度下的细菌和真菌群落的 β 多样性。不同诊断层土壤微生物群落在空间上呈现清晰的分离，PCoA 两轴共同解释了 27.69% 的细菌群落变异和 31.97% 的真菌群落变异 （图3d，h）。
图2土壤细菌群落组成和真菌群落组成（门水平）
注：（a）剖面土壤细菌群落组成；（b）剖面土壤细菌 AVS 数目；（c）剖面土壤真菌群落组成；（d）剖面土壤真菌 AVS 数目。
图3土壤微生物群落多样性
注：（a）剖面土壤细菌群落 ASV 水平下的 Ace 多样性；（b）剖面土壤细菌群落 ASV 水平下的 Sobs 多样性；（c）剖面土壤细菌群落 ASV 水平下的 Shannon 多样性；（d）剖面土壤细菌群落 ASV 水平下的 PCoA 分析；（e）剖面土壤真菌群落 ASV 水平下的 Ace 多样性；（f）剖面土壤真菌群落 ASV 水平下的 Sobs 多样性；（g）剖面土壤真菌群落 ASV 水平下的 Shannon 多样性；（h）剖面土壤真菌群落 ASV 水平下的 PCoA 分析。
2.4 土层深度决定土壤微生物群落的功能
使用原核生物类群功能注释（FAPROTAX）程序进行分析，能在一定程度上反映微生物群落的功能。本研究将特定细菌支系划分为功能群，共获得 61 个官能团。结果表明，相对丰度前 10 的功能类型占总丰度的 81％以上，各个功能团的相对丰度并不相同，化能异养（29.54%）和好氧化能异养（21.32%）是细菌群落在各个土壤剖面层次中相对占比最高的两个功能团（表4）。使用 PICRUSt2 功能预测，能在一定程度上预测功能丰度，共注释到 902 种酶，其中相对丰度前 10 的酶占总丰度的 21％以上（表4）。在所有剖面诊断层中，真菌主要酶为腺苷三磷酸酶、葡聚糖 1，4-α-葡萄糖苷酶和 DNA 引导的 RNA 聚合酶（表4）。
表4细菌 FAPROTAX 功能预测和真菌 PICRUSt2 功能预测
2.5 土壤微生物的驱动因素
冗余分析（RDA）揭示了环境因子与土壤微生物群落结构在门水平上的关系。细菌群落 RDA 的结果显示第一轴（RDA1）和第二轴（RDA2）分别解释了总方差的 19.03% 和 14.74%，真菌群落的 RDA1 和 RDA2 分别解释了总方差的 34.47% 和 18.12%（图4）。碱解氮和磷酸酶是细菌群落中最重要的因子（在 permutation 检验中，细菌的 R2 值分别为 0.5391 和 0.5085；两次检验的 P=0.001）； 蔗糖酶和有效磷是真菌群落最重要的因子（在 permutation 检验中，真菌的 R2 值分别为 0.2577 和 0.2032，P=0.006 和 P=0.013）（图4）。
对前 15 细菌门和真菌门的相对丰度和环境因子进行了 Pearson 相关性分析。结果显示，环境因子与部分细菌和真菌群落之间存在显著相关性，与真菌群落相比，细菌群落与环境因子的相关性更显著。在细菌群落中，放线菌门（Actinobacteriota） 与有机质、全氮、碱解氮、全磷、有效磷、速效钾、脲酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶呈显著正相关，与此相反的是，甲基肌酐菌门（Methylomirabilota）与全氮、碱解氮、脲酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酶呈显著负相关（图4b）。真菌群落的油壶菌门（Olpidiomycota）与 pH、有机质、全磷、有效磷、全钾和蔗糖酶呈显著正相关，而球囊菌门（Glomeromycota）与全磷、有效磷和全钾呈显著负相关（图4d）。
2.6 土层深度降低共现网络的复杂性
共现网络可以解释微生物群落成员之间复杂的关系。为了研究土壤剖面深度变化如何影响土壤微生物共现模式，本研究分析了土壤的微生物共现网络。根据节点数和边数，发现土壤微生物互作网络复杂度为表层土壤最高，包括 324 个节点和 754 条边，大多数节点均来自子囊菌门（Ascomycota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、变形菌门（Proteobacteria） 和酸杆菌门（Acidobacteriota）（图5）。第五层土壤微生物网络包括 79 个节点和 94 条边，77.66% 的边呈正相关（图5）。网络中细菌节点均多于真菌节点，正相关边数均高于负相关边数，并且第二层土壤正相关边数所占比例最高 （图5）。
图4土壤细菌和真菌与环境因子的冗余分析和相关性分析
注：（a）剖面土壤细菌门水平 RDA 分析；（b）剖面土壤细菌 Pearson 相关性分析；（c）剖面土壤真菌门水平 RDA 分析；（d）表示剖面土壤真菌 Pearson 相关性分析。SOM、TN、AN、TP、AP、TK、AK、UR、SC、CAT、ACP、NAG、β-GC 和 BD 分别为有机质、全氮、碱解氮、全磷、有效磷、全钾、速效钾、脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和容重。显著性差异：* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.01，*** 代表 P<0.001。
关键物种的特殊代谢功能对土壤微生物稳定性至关重要。本研究关键物种主要来自于细菌，包括变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门 （Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota） 和酸杆菌门（Acidobacteriota） 等，真菌主要来自子囊菌门（Ascomycota）。此外，第一层土壤有 418 个 ASV 被推断为关键物种（其中细菌有 273 个），第二层土壤有 168 个 ASV 被推断为关键物种（其中细菌有 108 个），第三层土壤有 80 个 ASV 被推断为关键物种（其中细菌有 52 个），第五层土壤（共 131 个，其中细菌有 109 个），而第四层土壤只有 30 个（ 其中细菌有 24 个） （图5）。
图5土壤细菌和真菌的共现网络分析
注：（a～e）剖面第一～五层土壤微生物共现网络分析；（f～j）剖面土壤细菌第一～五层土壤微生物的关键物种分布图；（k）不同土层的节点数量；（l）不同土层的边数量；（m）表示不同土层中正负相关边的比例，红色代表正相关，绿色代表负相关。
3 讨论
3.1 土壤微生物群落组成沿土壤剖面深度的变化
本研究证实，土层的深度显著影响了微生物群落，表层土壤微生物丰度高于底层土壤，且微生物丰度沿土壤剖面深度增加急剧下降，这可能是由于更深的土层中营养物质的稀缺所致[11]。土壤中寡营养菌（如绿弯菌门和酸杆菌门）在缺氧和营养贫瘠的底层土壤中相对丰度较高，而富营养菌（如变形菌门和放线菌门）的相对丰度则表现在营养较为丰富的表层土壤中较高，因此养分是影响剖面土壤微生物丰度的关键因素[12]。多数研究结果表明酸杆菌门具有嗜酸性的特点，与土壤 pH 呈显著负相关[13]。但本研究发现稻田剖面土壤中酸杆菌门在土壤 pH 较低的表层土壤中相对丰度低于 pH 较高的底层土壤。Xiong 等[14]的研究表明，一些酸杆菌的基因序列也在中性、甚至碱性的环境中被检测出来。导致这种现象的发生首先可能与酸杆菌不同亚群，甚至同一亚群不同的酸杆菌细菌对土壤环境因子响应存在差异有关。例如，酸杆菌相对丰度与其他环境因素具有相关性，碳可用性即是影响酸杆菌群落组成的因素之一[15]。其次可能是表层土壤受施肥等人为因素影响，对土壤微生物群落和相关过程产生负面影响[16]。因此除了土壤 pH 是普遍公认的决定酸杆菌丰度和多样性的重要因子外，其他未探知的因素也起到非常重要的作用。真菌群落对作物健康和土壤肥力至关重要。本研究观察到子囊菌门的丰度较高，子囊菌门在土壤剖面上的相对丰度通常表现为耕作层大于犁底层，随着剖面深度的增加其相对丰度又会有所增加，但当底层土壤砾石含量较高（>20%）时，相对丰度又有所降低。
土壤微生物群落生物量受土壤深度影响很大，深层土壤中的物种种类和连接度小于表层土壤，随着剖面深度的增加，土壤微生物互作网络复杂度逐渐降低，而第五层的土壤微生物互作网络复杂度高于第四层，这表明表层土壤相互作用较多，沿着剖面深度逐渐降低，而在母质层又有一定的恢复。表明底层微生物生态系统得到了一定的恢复。关键物种的概念在生态学中用于描述对其物种产生不成比例的巨大影响的单个物种。在本研究的关键物种中，第一层的物种丰富度较高，即表层土壤对外界的干扰具有较强的抵抗力[17]。关键物种在调控土壤养分循环和植物生长等关键生态过程中发挥独特作用，本研究发现第一层土壤中子囊菌的模块化最高，表明表层土壤具有良好的修复污染土壤的能力。
3.2 土壤微生物群落沿土壤剖面深度的功能及多样性变化
地下水位对土壤微生物有强烈影响[18]。地下水位较高的地块中微生物甲基营养、碳氢化合物降解和甲烷营养功能显著，而在地下水位较低的剖面中没有发现这个现象，造成这一结果的原因可能是在水位较高的情况下土壤中氧气含量较少，土壤中的甲烷菌是专性严格厌氧菌，不能在有氧气处生存，因此在淹水的土层中甲烷菌富集，通过产甲烷作用，有机废物可以转化成有用的甲烷。土壤中的碳氢化合物被微生物用作能量来源，当碳氢化合物浓度急剧增加时，例如靠近自然渗流时，碳氢化合物降解细菌的丰度在几天内呈指数级增长[19]，这与本研究结果相似。相较于其他诊断层，表层土壤中人类病原体相对含量较低，表明表层土壤中存在致病因子较其他层次少，这可能是由于表层土壤在种植过程中施用农药、除菌剂和进行的农业措施等，减少了表层土壤变形菌门的相对丰度，而变形菌门包括许多病原菌[20-21]。
微生物 α-多样性随着剖面深度呈下降趋势，但 LLJ 和 LLQ 剖面在 C 层又会有所上升（图4），即微生物 α-多样性沿土壤剖面深度增加表现出先下降后上升的趋势。先呈下降趋势可能是由于大多数细菌和真菌类群是好氧的，并且需要有机质分解提供的能量来维持它们的生长，因此下层土壤养分和氧浓度的降低导致了细菌和真菌 α-多样性的明显减少[22]，而后呈上升趋势一方面可能是由于人为因素对表层土壤微生物多样性的影响大于深层土壤[23]，人为因素致使表层土壤微生物多样性降低。另一方面可能是由于部分土壤微生物在深层和缺碳土壤中持续存在，能适应深层土壤中资源贫乏的环境[24]。
3.3 土壤微生物群落与土壤理化指标的相关性
pH 随着稻田土壤剖面深度的增加呈上升趋势 （图1）。表层土壤 pH 较底层低，其一方面可能是由于尿素和硫酸铵的施用会增加土壤中可交换的 Al3+ 和 H+ 浓度，导致土壤酸化[25]；另一方面可能是由于作物根系在表层密度较大，根系分泌物中含有的有机酸和醇在耕作层土壤中富集有关[26]。此外，土壤有机质、全氮、全磷和全钾随着土壤深度的增加而显著降低的现象已在许多生态系统中被报道[27]。有效磷含量随土壤剖面深度的增加而显著降低（图1）。这可能是由于水分是土壤养分和化学计量的主导因素，而稻田底层土壤的含水量通常大于表层土壤[28]。酶活性在剖面的顶部 30 cm 土层中最高，并逐渐降低到更深的水平[29]。本研究中特定酶活性随着深度的增加而增加（例如过氧化氢酶），这意味着在资源贫乏的底层土壤中，微生物可能会消耗更多的资源来获取更少的资源[30]。而造成表层土壤中的酶活性较高这一现象的原因可能是由于耕地中人为因素的影响。
施氮量是影响土壤细菌丰度变化的主要因素[31]。特别是针对富营养细菌，如变形菌门和放线菌门相对丰度与土壤中氮含量呈现相同的趋势，而寡营养类群（主要是酸杆菌门）表现出相反的模式[32]。同时，低氮含量会对土壤中的真菌丰度产生抑制作用[33]。本研究中全氮与放线菌门呈正相关（P<0.001）（图4），Ren 等[34]研究表明，长期施用氮肥会通过改变土壤 pH 对大多数主要土壤细菌物种产生重大影响，因此放线菌门可以作为检测长期施氮肥导致土壤 pH 下降的指标。真菌群落的驱动因素为蔗糖酶和有效磷，造成这个结果的原因也许是因为许多喀斯特地区的土壤缺磷，补充有效磷含量对微生物群落影响较大。
4 结论
与下层土壤相比，表层土壤在微生物多样性和群落功能方面展现出更高水平。微生物多样性呈现出先下降后上升的趋势，这意味着部分土壤微生物能够在底层土壤中持续存活或是适应了厌氧或贫营养的环境。进一步分析细菌和真菌的 AVS，均呈现出表层 >中层 >底层的分布趋势。在深层土壤中，富营养菌（如变形菌门和放线菌门）的相对丰度较低；而中层土壤中，病原菌的相对丰度则较高。
随着土壤剖面深度逐步增加，土壤微生物互作网络的复杂度呈现出先降低后升高的态势。这一现象意味着，表层土壤中微生物之间的相互作用较为频繁，随着深度不断增加，这种相互作用逐渐减少。然而，在底层土壤中，微生物生态系统的相互作用又出现了一定程度的恢复。
碱解氮和磷酸酶是影响细菌群落结构和分布的主要驱动因子，而蔗糖酶和有效磷则对真菌群落的影响最为显著。整体来看，在剖面土壤中排名前 15 的群落里，相较于真菌群落，细菌群落对环境因子的变化反应更为灵敏。环境因子的细微改变，都可能引发细菌群落结构和功能的明显变动，而真菌群落的变化相对而言则较为缓和。
