摘要
为了探明油菜与烤烟根际相互作用机制及对土壤平衡的影响，设置盆栽试验使烤烟与油菜营养生长期根际充分互作，通过 16S rDNA 高通量测序和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）检测等技术，分析种植油菜后作物根际土壤养分、酶活性、微生物多样性及差异代谢物的变化，及其联合作用对土壤中氮、磷、钾养分利用的调节，阐明油菜种植对土壤养分平衡的响应机制。结果表明，与烤烟单作相比，种植油菜后增加了植烟土壤有机质、碱解氮、有效磷含量，显著提高了土壤脲酶活性；提高了烤烟根际土壤青霉属、镰刀菌属真菌相对丰度，显著降低了腐质霉属真菌丰度；降低了烤烟根际土壤伯克霍尔德菌属以及油菜根际土壤鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属和伯克霍尔德菌属等细菌相对丰度。此外，种植油菜还降低了土壤差异代谢物含量，烤烟根际土壤主要富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、ABC 转运体、半乳糖代谢通路，油菜根际土壤主要富集在硫代葡萄糖苷生物合成、ABC 转运体、半乳糖代谢通路。综上，种植油菜通过调节土壤中微生物群落结构、功能和代谢产物丰度和功能，进而提高土壤氮、磷、钾养分的可利用性，通过改变种植模式为植烟土壤的改良提供一定的理论依据。
Abstract
In order to investigate the rhizosphere interaction mechanism of rapeseed and flue-cured tobacco and its influence on soil balance，a pot experiment was set up to make the rhizosphere of flue-cured tobacco and rapeseed fully interact during the vegetative growth stage. 16S rDNA high-throughput sequencing and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/ MS）detection techniques were used. The changes of crop rhizosphere soil nutrients，enzyme activity，microbial diversity and differential metabolites after planting rapeseed，and their combined effects on regulating the utilization of soil nitrogen， phosphorus and potassium were analyzed to clarify the response mechanism of rapeseed planting to soil nutrient balance.The results showed that，compared with monoculture of tobacco，the contents of soil organic matter，hydrolyzed nitrogen and available phosphorus were increased after intercropping with rapeseed，and the soil urease activity was significantly improved. The relative abundance of Penicillium and Fusarium fungi of tobacco rhizosphere soil was increased，and the abundance of Humicola fungi was significantly reduced. The relative abundance of bacteria such as Burkholderia in rhizosphere soil of tobacco，Blastomonas，Blastomonas，and Burkholderia in rhizosphere soil of rapeseed was reduced. In addition，the content of differential metabolites in the rhizosphere soil of tobacco was reduced，and was mainly enriched in alanine， aspartic acid and glutamic acid metabolism，ABC transporter and galactose metabolism pathway，while the rhizosphere soil of rapeseed was mainly enriched in glucosinolate biosynthesis，ABC transporter and galactose metabolism pathway. In conclusion，intercropping with rapeseed affected the microbial community diversity and function，and also the metabolites in the soil，which improved the nutrients of nitrogen，phosphorus and potassium in the soil. This study provided a theoretical basis for improving tobacco-planting soil by changing planting patterns.
Keywords
烤烟是我国重要的经济作物，多年连作会使植烟土壤生态系统失衡，有益微生物相对丰度减少、致病微生物相对丰度增加、土壤微生物生物量碳氮比下降，进而增加烟株病害[1]。目前，生产中常采用轮作、间作和套种其他作物的方式来改善植烟环境[2-4]，研究表明，物种多样性可提高土壤速效养分含量和酶活性，调节土壤微生物群落结构，消减烤烟连作障碍[5]。
根际是植物养分循环和土壤生物有机体定殖的关键区域[6]，土壤微生物可以释放多种土壤酶来合成腐殖质、矿化和降解有机物、促进或抑制循环养分[7]。大量研究表明，不同的植物类型可以在根际形成不同的微生物群落，周慕邱等[8]发现，烤烟间作大蒜显著提高了烟株根际土壤细菌群落的丰度、多样性和均匀度，Li 等[9]发现，苹果园间作甘草通过招募与根相关的根瘤菌来固氮并增加土壤总氮、碱解氮和有机质含量。改变种植模式还会影响土壤微生物群落的动态变化，导致土壤碳积累的相应变化[10]。此外，根分泌物作为植物和土壤之间物质和信号交换的基本通道[11]，部分分泌物有助于增强土壤化学性质，同时招募有利微生物菌落[12]。Wang 等[13]研究发现，脂质和放线菌的相互作用可能会改善间作系统中的土壤营养和细菌组成，豆科作物可以通过调节释放到根际的根系分泌物来促进互作植物的养分吸收[14]，代谢物质除了通过调节微生物群落影响土壤环境外还能直接调控土壤养分，植物可以通过释放有机酸溶解磷和硝化抑制剂直接释放有效氮来提高矿质养分的利用率[15]，Li 等[16] 发现，玉米释放类黄酮影响间作豆科植物固氮作用。大量研究表明，植物根际互作可以改变土壤微生物以及代谢物质的丰度和功能多样性，进而改变土壤中有机质、氮、磷等养分利用效率，从而调节植物生长。
近年来，关于根系分泌物调控下的“植物-土壤-微生物”互作机制研究逐渐增多[17-18]，不同作物间的相互作用存在显著差异，油菜根系形态和根系分泌物的特异性能改善土壤环境和微生物群落多样性，显著减少土传病原菌比例[19]。乔世佳等[20]发现，油菜体内含有大量硫代葡萄糖苷，对土传病害具有较强的抑制作用。目前，十字花科油菜与茄科烤烟互作对根系分泌物和土壤微生物群落结构的调控以及它们对土壤养分的作用机制尚不清楚。因此，本研究通过设计盆栽试验使油菜与烤烟根系充分互作，研究种植油菜对烤烟根际土壤酶活性、养分含量、微生物群落和代谢物质等微环境的影响，为大田生产上改良植烟土壤提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烤烟品种：红花大金元（玉溪中烟种子有限责任公司）；油菜品种：华油杂 50（丰鸿种业）；烟草专用复合肥：N-P2O5-K2O=10-10-25（云南云叶化肥股份有限公司）。
1.2 试验方法
2023 年 3—5 月在云南农业大学温室进行盆栽试验。试验土壤为农田红壤土，基本理化性质：pH 6.8、碱解氮 86.4 mg·kg-1、有效磷 22.5 mg·kg-1、速效钾 328.57 mg·kg-1、有机质 18.0 g·kg-1。试验容器为长形塑料花盆（50 cm×20 cm × 18 cm）。试验土壤过 1 cm 筛后与蛭石（0～2 mm）按体积比 3∶1 混匀，每盆 9 kg。试验共设置 3 个处理：烤烟单作（TM）、油菜单作（RM）、烤烟油菜互作（烤烟：TIR，油菜：RIT）。每个处理设置 15 个重复，每盆 2 株作物，间距 30 cm。烤烟苗床期 45 d 后移栽，油菜于烤烟移栽前 1 周播种；试验期间每盆施复合肥 41 g，分 3 次、间隔 15 d 将肥料泡水后均匀施入盆栽（按每公顷 16500 株施纯氮 67.5 kg 计算）。移栽后常规管理 40 d，期间每 3 d 定量浇水 2000 mL·盆 -1，根据环境温度及蒸腾情况适当调整浇水频率。
1.3 样品采集
分别采集 4 个处理的烟草和油菜样品。土壤样品采集选取各处理长势一致的 5 盆作物，去除植株周围表层 2 cm 的土壤，取出植株完整根系采用抖土法收集，过筛去除土壤中杂质获得根际土壤样品，一部分置于阴凉处风干、过 2 mm 筛后用于测定理化性质和酶活性，另一部分用冻存管采集暂存于装有液氮的聚乙烯箱中速冻 30 min 以上，随后保存在-80℃超低温冰箱，用于测定根际土壤微生物和分泌物。将植株根缓慢冲洗干净并擦干水分，地上、地下部分分别于 105℃杀青 15 min，在 75℃烘干至恒重并称量。
1.4 样品分析
土壤理化性质和酶活性测定：土壤 pH 采用水浸提法测定；土壤有机质含量采用重铬酸钾滴定法；土壤碱解氮采用碱解扩散法；土壤有效磷含量采用钼锑抗显色法；土壤速效钾含量采用乙酸铵-火焰光度法[21]。土壤蔗糖酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、脲酶活性均采用试剂盒测定（苏州格锐斯生物科技有限公司）。
植株地上 / 地下氮、磷、钾营养元素测定：将植株地上部、地下部干样依照《植物氮磷钾测定方法》（NY/T2017—2011）分别测定 N、P、K 含量和累积量。
采用 E.Z.N.A.TM 试剂盒提取土壤微生物基因组 DNA（g DNA），用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，并用 NanoDrop 2000 定量。利用 338F/806R 引物扩增整个细菌群落 16S rRNA 基因的 V3～V4 区域，使用 ITS1a 和 ITS1b 引物扩增真菌 ITS1 基因。PCR 扩增产物纯化后（Vazyme，南京，中国）用定量分析试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）定量，使用 illumina NovaSeq 平台和 NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 循环）双端测序（上海派森诺公司，中国）。
提取土壤代谢产物并进行广泛靶向代谢组学分析（中国武汉 Metware 生物科技有限公司）。取 50 mg 样品冰上解冻，用 500μL 冰甲醇 / 水（70%， v/v）匀浆后冰上孵育 15 min，4℃ 12000 r·min-1 离心 10 min，取 400μL 上清液到离心管。在沉淀中加入 500μL 乙酸乙酯 / 甲醇（V，1∶3），振荡 5 min 后冰上孵卵 15 min，4℃ 12000 r·min-1 离心 10 min，取 400μL 上清液，将两种上清液混合浓缩。干燥后加入 100μL 70% 甲醇水，超声 3 min。 4℃ 12000 r·min-1 离心 3 min，提取 60μL 上清液进行 LC-MS/MS 分析。土壤中分泌物检测使用超高效液相色谱仪（Agilent 7890，Santa Clara，CA，美国） 和质谱仪（QTOF/MS-6545，LECO，St. Joseph，MI，美国）。
1.5 数据分析
采用独立样本 t 检验分析种植模式对植株不同器官养分含量以及土壤理化性质、酶活性的影响。所有数据均表示为平均值 ± 标准误（SE），统计分析、方差齐性检验和正态性检验均使用 SPSS 22.0 进行，运用 Origin 2021 绘图。
微生物数据分析：α-多样性指标，β-多样性指标使用多样性 plugin 进行估计，对 99% OTUs 参考序列进行 ASV 分类，计算微生物 ASV 水平α多样性指数和β多样性分析。序列数据分析主要使用 QIIME2 和 R 3.2.0 采用 spearman’s rank 分析法对前 50 个丰度最高的细菌和真菌群落进行网络分析不同种属之间的关系。基于 spearman 强等级相关系数（ρ>0.6）和显著的相关性（P <0.01），使用 Gephi 0.10.1 可视化探索土壤微生物群落的共生模式。每个节点的大小表示与其他节点的连通性大小，节点按门分类着色。KEGG 途径富集分析差异代谢物。对不同处理组土壤中差异代谢物的分析在迈维平台（https：//cloud.metware.cn） 进行，采用方差分析和 OPLS-DA 相结合的方法进行关键差异代谢物筛选和 VIP 分析（P <0.05 且 VIP >1），用偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析根际微生物和代谢物之间的影响及对土壤氮、磷、钾养分的综合调节机制。
2 结果与分析
2.1 种植油菜对烤烟养分的影响
种植油菜后，烤烟根系全氮、全磷和全钾积累量显著低于单作，地上部分生物量、全氮、全磷积累量呈上升趋势。表明与单作相比，油菜降低了烤烟地下根对养分的积累，对地上营养物质的积累有促进作用（图1）。
图1种植模式对作物养分积累的影响
注：图中横坐标以上为植物地上部分（茎和叶）生物量及养分含量，以下为根部生物量及养分含量；* 表示两组间差异具有显著性（* 表示 0.01 ≤ P <0.05，** 表示 0.001 ≤ P <0.01，*** 表示 P <0.001；n=3）。下同。
2.2 种植油菜对作物根际土壤理化性质和酶活性的影响
与单作相比，烤烟油菜互作显著增加或增加了烤烟和油菜根际土壤有机质、有效磷含量（图2 b、d）； 增加了烤烟根际土壤过氧化氢酶、脲酶和酸性磷酸酶活性，显著降低了蔗糖酶活性；互作显著降低了油菜根际土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，显著增加了油菜根际土壤过氧化氢酶活性 （图3）。表明油菜种植有利于活化和增加土壤中有机质、氮和磷等养分含量。
2.3 种植油菜对作物根际土壤微生物多样性和功能的影响
2.3.1 不同种植模式下土壤微生物群落及核心种属分析
烤烟和油菜根际土壤真菌和细菌 ASVs 数分别为 6903 和 19983。其中烤烟单作和互作根际土壤中真菌特有 ASVs 数分别为 1217 和 1190，细菌特有 ASVs 数分别为 3118 和 3063；油菜单作和互作根际土壤真菌特有 ASVs 数为 1284 和 999，细菌特有 ASVs 数为 2747 和 3742。结果表明，与单作相比，互作降低了烤烟根际土壤真菌、细菌和油菜根际土壤真菌特有 ASVs 数，提高了油菜根际土壤细菌特有 ASVs 数（图4）。
对作物根际土壤微生物群落组成在属水平丰度前 15 的菌群进行分析（图5），主要的优势真菌属分别是：青霉属、腐质霉属和镰刀菌属，种植油菜后提高了烤烟根际土壤青霉属、镰刀菌属相对丰度，腐质霉属真菌相对丰度显著下降；互作较单作降低了油菜根际土壤青霉属相对丰度，腐质霉属和镰刀菌属相对丰度升高（图5a）。主要的优势细菌属分别是：鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属和伯克霍尔德菌属，互作较单作降低了烤烟根际土壤伯克霍尔德菌属以及油菜根际土壤鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属和伯克霍尔德菌属相对丰度（图5b）。
图2烤烟油菜互作对作物根际土壤理化性质的影响
图3烤烟油菜互作对作物根际土壤酶活性的影响
图4烤烟和油菜根际土壤真菌、细菌 Venn 图（ASV 水平）
注：a 为真菌，b 为细菌；图中每个圈代表一个样本，圈与圈重叠部分的数字代表样本间共有的 ASV 个数，没有重叠部分的数字代表样本的特有 ASVs 个数。
2.3.2 作物根际土壤微生物共现网络分析
对烤烟和油菜根际土壤丰度前 50 的优势细菌和真菌属进行共现网络分析（图6）和总结 （表1），表明根际土壤细菌和真菌网络主要节点属于 12 个细菌门和 9 个真菌门，主要为子囊菌门、变形菌门和放线菌门。互作后较单作烤烟和油菜根际土壤子囊菌门和壶菌门真菌相对丰度降低，土壤芽单胞菌门细菌相对丰度升高，放线菌门和变形菌门细菌相对丰度降低。与单作相比，互作后烤烟根际土壤微生物网络平均聚类系数、图密度、平均度、边数和正负相关边数升高，油菜则相反，同时烤烟网络模块化指数和平均路径长度降低。表明互作后增加了烤烟根际土壤细菌和真菌的相关性，降低了油菜根际土壤细菌和真菌的正相关比例。烤烟和油菜根际土壤细菌和真菌的正相关性大于负相关性，即互惠关系大于竞争关系。
图5不同种植模式属水平上的土壤真菌群落组成和细菌群落组成丰度
注：a 为真菌，b 为细菌。
图6不同种植模式下土壤微生物共现网络图
注：连接表示具有统计学意义（P<0.01）的强正相关（红色，Spearman’s P >0.6）或负相关（蓝色，Spearman’s P<-0.6）。每个节点的大小与连接边缘数成正比，相同颜色的节点隶属于同一门，两个节点之间每个连接的厚度与 Spearman 相关系数 P>0.6 或 P <-0.6 的值成正比。
2.3.3 作物根际土壤微生物功能预测
采用 FUNGuild 数据库对根际土壤真菌群落进行功能预测，发现不同处理的真菌功能为腐生型、病理型和共生型三大类型。与单作相比，种植油菜后烤烟根际土壤中昆虫寄生虫、植物病原体、线虫和植物腐生菌等功能的真菌相对丰度下降，木质腐生等功能的真菌相对丰度上升（图7a）；种植烤烟后油菜根际土壤昆虫寄生虫、杜鹃花菌根等功能真菌相对丰度下降，兰花菌根和外生菌根等功能真菌相对丰度上升（图7b）。
表1不同种植模式下土壤微生物共现网络拓扑学参数
利用 FATROTAX 数据库对细菌的相关生态功能进行预测，表明不同处理作物根际土壤中细菌共涉及到 49 类功能，主要为化学异养、需氧化学异养、尿素溶解、芳香族化合物降解和硝酸盐还原等功能。与单作相比，种植油菜后提高了烤烟根际土壤中化学异养和需氧化学异养的细菌相对丰度，降低了尿素溶解、芳香族化合物降解的相对丰度 （图7c、d）。
2.4 种植油菜对作物根际土壤代谢物的影响
2.4.1 种植油菜对作物根际土壤差异代谢物丰度的影响
不同种植模式下烤烟根际土壤共筛选出 172 个差异代谢物，其中 35 个上升，137 个下降，显著上升的类型主要归属于生物碱、酚酸类、氨基酸及其衍生物等，显著下降的类型主要归属于生物碱、有机酸等。油菜根际土壤共筛选出 136 个差异代谢物，其中 98 个上升，38 个下降，显著上升的主要归属于生物碱、酚酸类、氨基酸及其衍生物等，显著下降的主要归属于生物碱、有机酸等物质（图8a、b）。
图7不同种植模式下土壤微生物功能多样性
注：a 为烤烟根际土壤真菌功能多样性热图；b 为油菜根际土壤真菌功能多样性热图；c 为烤烟根际土壤细菌功能多样性柱形图；d 为油菜根际土壤细菌功能多样性柱形图。
OPLS-DA 模型中 VIP 值前 20 的代谢物聚类分析表明，与单作相比，种植油菜后烤烟根际土壤中 4-羟基苯乙酮、乙酸苯酯等 11 种差异代谢物显著上调，3-吲哚丙烯酸*、L-脯氨酸* 等 9 种显著下调（图8c），显著上调了油菜根际土壤中烟碱、L-异亮氨酸* 和 6-氨基己酸等 16 种差异代谢物，2-苯乙胺、吲哚-5-甲酸* 等 4 种显著下调 （图8d，表2）。互作后烤烟和油菜根际土壤差异代谢物上升大于下降。
2.4.2 差异代谢物 KEGG 富集分析及功能注释
烤烟根际土壤差异代谢物显著富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、ABC 转运体、半乳糖代谢等 9 个代谢途径（图9a），差异代谢物含量主要表现为下降。油菜差异代谢物显著富集在硫代葡萄糖苷生物合成、ABC 转运体、半乳糖代谢、2− 氧代羧酸代谢等 6 个途径（图9b），其中硫代葡萄糖苷生物合成、2− 氧代羧酸代谢、氨基酸代谢和胺酰-tRNA 合成途径主要表现为上升，ABC 转运体和半乳糖代谢途径主要表现为下降。
2.5 土壤化学性质、土壤微生物群落和代谢物质的相关性分析
采用偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析互作对烤烟与油菜根际土壤养分、酶活性、微生物丰度和代谢物之间关系的影响。结果表明，烤烟和油菜模型拟合优度（GoF）分别为 0.667 和 0.7342，拟合较好。对于烤烟而言，种植油菜对土壤酶活性有显著的正向效应，对土壤微生物和代谢物则是显著的负效应，土壤微生物对养分具有显著的正效应 （图10e）。对于油菜而言，种植烤烟对土壤代谢物有显著的正效应（图10f）。表明种植油菜对烤烟的根际土壤氮、磷、钾养分和酶活性有正效应。
图8烤烟油菜互作不同组别差异代谢物火山图及主要差异代谢物的聚类热图
注：a、c 为 TIR vs TM；b、d 为 RIT vs RM。c、d 中的 * 表示该物质存在同分异构体。
表2不同处理的土壤中显著差异代谢物
注：* 表示该物质存在同分异构体。
图9烤烟和油菜不同种植模式引起的差异代谢物 KEGG 富集分析及功能注释
图10关联分析
注：a、b 分别为烤烟和油菜根际土壤代谢物质与细菌门水平 Spearman 相关性热图；c、d 分别为烤烟和油菜根际土壤细菌与土壤环境因子的 Mantel 分析；e、f 分别为烤烟和油菜土壤养分、土壤酶活性、土壤微生物群落和土壤代谢物的偏最小二乘路径模型（PLSPM）。图 a、b 中左侧纵坐标为差异代谢物种类，上方横坐标表示不同细菌门；颜色代表相关性，红色代表正相关，蓝色代表负相关，* 表示显著相关（P<0.05），** 表示极显著相关（P<0.05）。图 c、d 中 AP 为有效磷，AK 为速效钾，AN 为碱解氮，OM 为有机质，pH 为酸碱度；线条粗细代表 Mantel 相关 r 值，线条颜色代表 Mantel 相关 P 值，热图颜色代表 Spearman 相关系数。图 e、f 中红色和蓝色箭头分别表示通路效应的正效应和负效应，实线表示效应显著，虚线表示效应不显著，线段上方的数字表示路径系数，R2 表示每个变量被解释方差的比例（* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01， *** 表示 P<0.001）。
3 讨论
3.1 种植油菜对土壤化学性质和植株养分的影响
本研究发现，与油菜互作后增加了烤烟根际土壤有机质、碱解氮、有效磷含量，这可能与土壤脲酶和蔗糖酶活性显著提高有关。脲酶能提高土壤中氮和碳化合物的含量，促进尿素的水解，其代表了土壤氮含量的水平，能有效促进有机碳的转化[22]，蔗糖酶与土壤有机质降解密切相关[23]，李金秋等[24] 也发现，烤烟套作草木樨能提高土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性，和本研究一致，表明间作通过提高养分相关酶活增强土壤肥力。此外，作物间合理的相互作用可以通过作物对养分需求的不同促进养分的有效转化与吸收[25]。杜青峰等[26]发现，玉米间作绿肥后玉米的全氮和全磷含量显著增加，本研究中和油菜互作后烤烟地上器官中全氮、全磷含量较单作有增加的趋势，可能是间作促进土壤酶的释放以激活土壤养分，从而增强植物对氮和磷的吸收[27]，增加了烟株生物量。因此，和油菜根际互作可能会通过直接改善烟草根际养分循环来促进烟草生长[28]。
3.2 种植油菜对土壤微生物多样性的影响
作物间相互作用有利于改变土壤微生物群落的多样性、组成和结构及群落相互作用关系，实现功能转变。在本研究中，与油菜互作增加了烤烟根际土壤中青霉菌属、镰刀菌属的相对丰度，青霉菌属是具有生物防治效果的有益真菌[29]，有些镰刀菌可能竞争性抑制烟草根腐病菌[30]，推测与油菜互作有利于降低烟草根腐病原菌。在细菌水平上，与油菜互作提高了根际土壤中芽单胞菌门相对丰度，芽单胞菌门对土壤氮素循环中反硝化作用具有重要意义，其相对丰度增加有助于提高土壤氮利用效率[31]。FunGuild 功能预测发现，烤烟油菜互作降低了土壤病理营养型真菌相对丰度，共生和腐生营养型真菌相对丰度增加，腐生真菌是土壤有机质的重要分解者[32]，子囊菌门主要以腐生菌为主，能分解土壤中难降解的有机物从而促进土壤养分的不断循环利用[33]，共生型真菌如外生菌根真菌能提高宿主抗逆性[34]，兰花菌根对氮的运输同化有重要作用[35]，表明与油菜互作对土壤中真菌营养类型具有一定正向影响，促进了功能菌的丰度增加，减少了真菌性病害发病率，油菜和烤烟根际互作可以通过提高土壤功能微生物群落丰度，增强对氮、磷等养分的吸收利用。
3.3 种植油菜对土壤差异代谢物质的影响
研究发现，生物碱、糖类、脂质和酚酸类是烤烟和油菜根际土壤最主要的差异代谢物。生物碱既参与多种生理过程、促进植物生长，又可以抑制细菌生长[36]，脂质是促进植物适应非生物胁迫的一类主要物质[37]，糖类作为主要碳源为微生物代谢活动提供能量，酚酸类物质过度积累会改变土壤环境，增加病原类真菌引起植物病害[38]。VIP 值前 20 的代谢物聚类分析表明，与油菜互作后烤烟根际土壤中 α-羟基肉桂酸 *、6-甲氧基-2-苯并恶唑啉酮等 11 种差异代谢物显著上升，α-羟基肉桂酸 * 能最大限度地减少氧化损伤，以维持细胞稳态并保护重要的细胞成分免受伤害[39]，6-甲氧基-2-苯并恶唑啉酮是在作物互相靠近时积累量增加，对病原性真菌（如镰刀菌属）具有拮抗作用[40]。因此，推测与油菜根际互作通过改变土壤差异代谢物来提高烤烟的抗性。Duan 等[41]研究发现，茶树-大豆间作会影响与谷氨酸、赖氨酸和精氨酸代谢相关物质表达，改善有机质和总氮等土壤养分[42]。烤烟根际土壤差异代谢物显著富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，其能促进作物根系对磷的吸收和积累[43]，与油菜互作可能通过调节代谢途径来影响土壤中氮、磷等养分的可利用性并进一步调节作物对养分的吸收。
3.4 关联分析
不同物种之间活性代谢物的渗出量存在很大差异，其微生物群落和植物-土壤反馈效应也存在很大差异[44]。核心差异代谢物组成和比例对于在门和属水平上招募有益的关键微生物类群起着至关重要的作用，对前 20 的差异代谢物与细菌门水平进行 Spearman 相关性分析（图10a、b），发现油菜根际土壤中苜蓿素-4’-O-葡萄糖苷 *、二羟基二甲氧基黄酮 * 等与疣微菌门、装甲菌门呈显著正相关，张松林等[45]也发现，丹参酮Ⅱ A 含量与疣微菌门呈显著正相关，说明疣微菌门能促进苜蓿素-4’-O-葡萄糖苷 *、二羟基二甲氧基黄酮 * 含量的积累。烤烟根际土壤中 4-硝基苯酚、3-氯苯胺与厚壁菌门呈显著正相关，L-脯氨酸 *、烟碱与厚壁菌门呈显著负相关。采用 Mantel 检验评估土壤环境因子对门水平上细菌群落组成的影响 （图10 c、d），发现各细菌门与土壤环境因子具有相关性，其中厚壁菌门与土壤有效磷显著相关，装甲菌门与土壤速效钾显著相关。前人研究发现，厚壁菌门与土壤养分中的水解氮、酸性磷酸酶呈显著负相关[46]，装甲菌门与碱解氮呈显著负相关[47]。综上所述，烤烟与油菜互作可以通过特定的根系分泌物影响土壤微生物，促进养分转化和植物吸收利用。
4 结论
烤烟与油菜营养生长期根际充分互作的盆栽试验表明，与油菜互作种植较烤烟单作显著增加了土壤有机质、碱解氮、有效磷含量，显著提高了烤烟根际土壤脲酶和蔗糖酶活性。与单作相比，与油菜互作种植后增加了烤烟根际土壤青霉属、镰刀菌属真菌、芽单胞菌门相对丰度，显著降低了腐质霉属真菌丰度，对土壤中真菌营养类型具有一定正向影响，促进了氮、磷等养分相关功能菌的丰度增加。研究表明，与油菜互作通过改变根际代谢产物丰度，招募有益土壤微生物，进而激活养分相关酶活性改良土壤养分；初步探讨了与油菜根际互作提高植烟土壤肥力及养分利用的生理和代谢机制，为改变烤烟种植模式和增加作物多样性来改良土壤提供一定的理论依据。
