摘要
磷是植物生长发育的关键营养元素，但土壤中磷素常以植物难以吸收的形式存在。将芽孢杆菌 HJB17 衍生的碱性磷酸酶（PB）和生物多糖复合物（BPS）结合制备碱性磷酸酶载体复合物（P-BPS），分析其酶学性质和研究其在土壤中的活性变化。酶学性质表明，P-BPS 和 PB 最适反应温度均为 37℃，P-BPS 相较于 PB 在高温下表现出更强的耐受性。P-BPS 55℃时活性基本不受影响，在 65℃仍能保持较高活性。此外，还分析了 P-BPS 对 4 个地区土壤样品有效磷、3 个地区番茄植株生长前后土壤样品有效磷和 2 个地区番茄植株生长指标的影响。结果表明：（1）4 个地区初始有效磷不同的土样中，P-BPS 都是在加入样品的 0.5% 时有效磷增长率最高，河南信阳、山东青岛、广西巴马、广东新会最高分别可达到 40.1%、49.5%、48.6%、49.1%；（2）番茄试验田的土壤有效磷也有增长，添加量为 0.5% 时最高，平谷、北京林业大学校内、青岛试验田增幅分别为 27.9%、28.1%、29.0%； （3）在加入有机肥 0.5% 时，平谷试验田番茄株高、主根长均增幅 116%、56%，北京林业大学内试验田分别增幅 82%、90%。综上所述，外源性添加 P-BPS 能够提升土壤有效磷含量，P-BPS 的直接应用可以作为土壤磷肥力的可持续来源。
关键词
Abstract
Phosphorus is a critical nutrient for plant growth and development，but it often exists in forms in the soil that are not readily accessible to plants．In this study，an alkaline phosphatase（PB）derived from Bacillus subtilis HJB17 and a biopolysaccharide（BPS）composite were combined to form an alkaline phosphatase-biocarrier complex （P-BPS）．The enzymatic properties of P-BPS were evaluated，and its activity in soil was assessed．Enzyme activity analysis revealed that both P-BPS and PB exhibited an optimal reaction temperature of 37℃，with P-BPS demonstrating superior thermal stability compared to PB．At 55℃，the enzyme activity of P-BPS remained largely unaffected，and it still maintained substantial activity at 65℃．Additionally，the effects of P-BPS on the available phosphorus content in soil samples from four regions，as well as on soil samples before and after the growth of tomato plants from three regions，and tomato plant growth indicators in two regions were investigated．The results indicated that：（1）In soil samples from four regions with varying initial levels of available phosphorus，the highest increase in available phosphorus content was observed when P-BPS was added at 0.5%，with maximum increases of 40.1%，49.5%， 48.6% and 49.1% in Xinyang Henan，Shandong Qingdao，Guangxi Bama and Guangdong Xinhui，respectively； （2）In tomato experimental fields，soil available phosphorus content also increased，with the highest increments observed at 0.5% addition，showing increases of 27.9%，28.1% and 29.0% in Pinggu，Forestry University，and Qingdao experimental fields，respectively；（3）Regarding tomato plant growth，the addition of 0.5% P-BPS resulted in increases in plant height and main root length of 116% and 56%，respectively，in Pinggu experimental fields，and 82% and 90%，respectively， in Beijing Forestry University experimental fields．In conclusion，the exogenous application of P-BPS effectively enhanced the bioavailability of phosphorus in soil，and its direct use could provide a sustainable source of phosphorus fertility in agricultural soils.
磷（P）是植物生长发育过程中不可或缺的营养元素之一，在众多生物化学过程中发挥着关键作用。它是核酸（如 DNA 和 RNA）、磷脂、三磷醇腺苷等重要生物分子的组成部分，参与了能量传递、遗传信息储存以及细胞膜结构的构建等关键生命活动[1-3]。磷素的充足供应对于维持植物正常的生理代谢、促进根系发育、增强光合作用效率以及提高作物产量和品质具有不可替代的重要性[4]。土壤中的 P 储量仅以有机和无机 P 储量的形式存在。无机磷来自矿物质的风化和过量的肥料输入，这些肥料以钙、铝、锰和铁的水合氧化物的形式沉积在土壤中。有机磷以磷酸盐、肌醇、核酸、磷脂或核苷酸的形式存在，它们从植物残留物和粪便中沉积到土壤中[5]，占总磷储量的 30%～80%[6]。尽管土壤中总磷含量可能并不低，但其中大部分磷以植物难以直接吸收利用的有机磷形式存在，尤其是磷酸盐，其在土壤有机磷中占据了相当大的比例[7]。磷酸盐参与多种生理生化反应，包括光合作用、根茎发育、花和种子形成、作物成熟和植物抗病等。磷酸盐是限制作物产量的重要因素之一[8]。
磷酸酶是由植物和土壤微生物产生的酶，能够水解有机磷，微生物能够产生酸性和碱性磷酸酶，而植物只能产生酸性磷酸酶[11]。微生物来源的磷酸酶因其催化活性高、底物特异性强以及在不同环境条件下的相对稳定性而备受关注[12-13]。其中，碱性磷酸酶（PB）作为一类重要的微生物碱性磷酸酶，具有独特的结构和优良的酶学性质，如对磷酸盐的严格特异性、抗蛋白水解能力以及在一定范围内的 pH 和温度稳定性[14-15]。研究表明，磷酸酶还可能对土壤理化性质产生积极影响，如改善土壤团聚体结构和促进土壤微生物活性等，进而为植物生长创造更加有利的土壤环境[16]。然而，蛋白质酶的生产成本很高，基于这个问题，酶生物活性保护研究受到广泛关注[17]。酶生物活性保护方法包括与载体结合、交联和封装，将酶分子附着或掺入大型结构中[18]。根据课题组现行改良的方法，本试验采用多糖复合物（BPS）作为载体对 PB 固定化，得到碱性磷酸酶载体复合物（P-BPS）。本研究旨在探讨 P-BPS 对土壤有效磷含量的提升作用及其对番茄植株生长的影响，并研究了 P-BPS 的酶活性，为开发可持续的农业磷素管理策略提供理论依据和实践指导。
1 材料与方法
1.1 PB 的构建、表达、纯化以及复合物的制备
本研究中使用的双结构域β-螺旋桨磷酸酶 （PB）基因（HM003049.1）来自芽孢杆菌 HJB17 菌株。本研究将实验室保存的重组质粒 pET-28b（+）-PB[19]转化到大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞中。使用高伟等[20]的透析方法重新折叠包涵体。变性和复性处理后得到的蛋白单体采用多糖复合物 （BPS）作为制备保护载体的原料，将 PB 与 BPS 制备的多孔载体进行交联得到 P-BPS 复合物，酶活性为 38 U/mg。P-BPS 复合物酶学特性：最适温度 37℃，最适 pH 8.0，0～65℃内有很强的热稳定性。
1.2 PB 和 P-BPS 活性分析与比较
磷酸酶活性采用改良的硫酸亚铁钼蓝法从磷酸盐中测定释放的磷酸根的量来确定[21]。测定 PB 和 P-BPS 活性-温度曲线。在 10、20、30、35、45、 55、65℃，PB 和 P-BPS200 r/min 摇床条件下测定的活性。在最佳温度下，测定在 pH 为 3、4、5、 6、7、8、9 水平下在 200 r/min 摇床振荡 30 min 后的磷酸酶活性。
1.3 影响土壤中 P-BPS 磷酸酶活性的因素
土壤样本采自北京市海淀区北京林业大学校内 （40°00′05″N，116°20′28″E，海拔 50 m），采样深度为 10～20 cm，将其风干、过筛后在室温下储存。根据 George 等[22]描述的方法。将 0.5 g P-BPS 接种到灭菌后的土壤和非无菌土壤悬浮液 1、3、5、 12 和 24 h，测量时间和微生物的存在对磷酸酶活性的影响。测量总酶活性（土壤悬浮液中的 P-BPS 活性）。通过以 13000 r/min 离心 15 min 分离土壤和溶液，以测量溶液相中的磷酸酶活性。每个处理 3 份重复。
1.4 土壤样品准备与处理和 P-BPS 对 4 个土壤来源地区有效磷的测定
1.4.1 土壤样品的来源和准备
供试土壤类型样本来源于河南省信阳市工业园农场农田 3 个土样、山东省青岛市黄岛区农场 2 个土样、广西壮族自治区河池市巴马自治县农场农田 6 个土样和广东省江门市新会区农田 1 个土样，共 4 个地区 12 个土壤样品。采样深度为 10～20 cm，在室温下储存。
1.4.2 P-BPS 对来源于 4 个地区土样有效磷含量的测定
土壤样品经高压灭菌、烘干、研磨、过 2 mm 筛后进行土样样品的处理：称量 3 份同样质量的土壤样品，分别加入占土壤样品质量的 0.1%、 0.2%、0.5% 的 P-BPS 样品，然后将加入 P-BPS 的土样样品置于 100 mL 锥形瓶中，在锥形瓶中加入 20 mL 的蛋白缓冲液 buffer（pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2），充分混匀。以上述土样样品的处理相同的步骤重复 7 组。将 8 组土壤样品在恒温振荡器 30℃分别以 200 r/min 摇 1、2、3、5、10、 20、48、72 h，并且做好标记。同时设置对照组的土壤样品。将在恒温振荡器反应后的土样样品置于烘箱在 55℃下烘干后，过 2 mm 筛，按照土壤有效磷测定国家标准[23]进行土壤中有效磷的测定。
本试验每个土样共设置加入占土壤质量的 0.1%、0.2%、0.5% 的 P-BPS 样品，每个比例样品设置在 30℃恒温振荡培养器中分别以 200 r/min 摇 1、 2、3、5、10、20、48、72 h 共 8 组，并设置一组不加 P-BPS 样品在恒温振荡器摇 1、2、3、5、10、 20、48、72 h 的对照。每个试验样品 3 个重复。
1.5 P-BPS 对番茄植株生长的作用
在北京市平谷区金海湖镇马屯地区（简称平谷试验田）、北京林业大学校内（简称校内试验田） 选用的番茄幼苗品种为大粉果番茄，购自北京农业科学院，种植面积分别为 16、14 m2，在山东省青岛市黄岛区（简称青岛试验田）选用的番茄幼苗为小粉果番茄，面积为 15 m2。
在各试验田内，按照株、行距 30 cm，在每个地区分别移栽 20、24、12 株番茄幼苗。
各地区西红柿样品在种植 1 个月后每株添加 100 g 的有机肥，并按表1所示添加占有机肥样品相应比例的 P-BPS 样品。在经过 4 个月生长周期之后，测定每个处理条件下的植株高、主茎粗、植株主根长度以及主侧根数量。
表1种植番茄植株的 3 个试验田
注：表中 0.1%～0.5% 为施用有机肥的质量百分比。下同。
1.6 P-BPS 对番茄植株地区土壤的作用
在番茄植株种植之前，分别在每个试验田内取土样以测定土壤的初始有效磷含量。在番茄生长周期结束时，分别从每株番茄根系旁（根部深度 5 cm，距离根系 2～5 cm）的土壤中采样[24]。
1.7 数据处理和统计方法
为评估 P-BPS 对番茄植株的试验效果，采用 SPSS26.0 进行数据处理和分析，通过方差分析 （ANOVA）和事后检验 HSD Tukey’s 多重检验处理与对照之间的显著性差异，结果用图表和统计数据形式呈现。数据用 Excel 2010 进行平均数及标准误差的计算，采用 Origin 8.6 绘图。采用 SPSS 26.0 作单因素分析（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 P-BPS 和游离碱性磷酸酶的酶学性质比较
从图1a中可以看到，PB 和 P-BPS 的最适反应温度均为 37℃。在 65℃时，PB 活性完全丧失。P-BPS 在 65℃时仍能保持 86% 的活性。图1b展示了 pH 对 PB 和 P-BPS 活性的影响。PB 和 P-BPS 的最适反应 pH 均为 8.0。当 pH 值大于 8.0 时，PB 的活性降低程度高于 P-BPS。
2.2 灭菌与未灭菌土壤中 P-BPS 活性动态差异
通过对比高压蒸汽灭菌土壤与未灭菌土壤中 P-BPS 的活性变化（图2），发现灭菌处理在 2 h 后显著减缓了酶的失活速率，单次高压蒸汽灭菌虽能灭活微生物，但无法完全消除其代谢产物（如蛋白酶、有机酸）的遗留效应。灭菌后残留的微生物产物（如耐热蛋白酶）可能通过水解作用持续影响酶活性，此外，高温会增强磷酸酶在土壤中的吸附，这种吸附作用可能为磷酸酶提供了保护机制，从而影响其稳定性[25]。
2.3 P-BPS 样品对各地区土壤样本有效磷含量变化的影响
图3中，0.1%～0.3% 为加入 P-BPS 占土样的百分比，CK 为对照。外源添加 P-BPS 对各地区的土壤有效磷均有增长效果，并随着 P-BPS 添加量的增加而增加，在达到 48 h 后增长速度放缓。在初始有效磷为 0～10 mg/kg 的土壤样品中，孵化时间 48 h，添加有机肥质量的 0.5% 的 P-BPS 后有效磷平均增幅为 24.8%，初始有效磷为 10～20 mg/kg 的土壤样品中平均增幅为 35.6%，初始有效磷为 20～30 mg/kg 的土壤样品中平均增幅为 49.2%。图4为 P-BPS 添加量分别为 0.1%、0.2%、0.5% 土壤有效磷的增长率，从图3、4可以看出，土壤有效磷的增加量和土壤的基础磷素与 P-BPS 添加量有关。P-BPS 添加量为 0.5% 时，土壤有效磷的增幅最明显。
图1温度和 pH 对 PB 和 P-BPS 活性的影响
图2灭菌对土壤中 P-BPS 活性的影响
注：P-BPS 的量为 0.5 g。
图3P-BPS 对 4 个地区土壤样品有效磷含量的影响
注：a 为广西巴马土壤样品，b 为河南信阳土壤样品，c 为山东青岛土壤样品，d 为广东新会土壤样品。
图4外源性添加 P-BPS 对土壤样品有效磷的增长率变化
注：a、b、c 分别为 P-BPS 添加量为 0.1%、0.2%、0.5% 时 12 个土样有效磷增长率（相较于 CK 增长的幅度）的变化；BM1、BM2、BM3、 BM4、BM5、BM6 为广西巴马土壤样品，XY1、XY2、XY3 为河南信阳土壤样品，QD1、QD2 为山东青岛土壤样品，XH 为广东新会土壤样品。
2.4 P-BPS 对两个地区西红柿植株生长的作用影响
图5中 0.1%、0.2%、0.5% 为有机肥质量的百分比，从图5可知，在平谷试验田和校内试验田，添加不同比例 P-BPS（0.1%、0.2%、0.5%）的处理在株高和主根长度上均比 CK 有不同程度的增加。由表2和表3可知，平谷试验田在加入 100 g有机肥和有机肥的 0.5% P-BPS 时番茄植株株高增幅为 116%，主茎直径增幅为 145%，主根长度增幅为 56%；校内试验田番茄植株株高增幅为 82%，主茎直径增幅为 130%，主根长度增幅为 90%。由此可见，添加 P-BPS 能够有效地促进番茄植株的生长。
图5P-BPS 对番茄植株生长的影响
注：a 为校内试验田，b 为平谷试验田；0.1%、0.2%、0.5% 表示 P-BPS 占施用有机肥的质量百分比。
表2P-BPS 的添加对北京市平谷区试验田番茄植株生长参数的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。表中数字为平均值 ± 标准差。下同。
表3P-BPS 的添加对北京林业大学校内试验田番茄植株生长参数的影响
2.5 P-BPS 对番茄植株地区土壤的作用
图6中，CK 为种植番茄植株前土壤有效磷含量。在不同地区的番茄植株土壤中，添加 P-BPS 均对土壤有效磷含量有显著影响。在所有处理中，随着 P-BPS 添加量的增加，土壤有效磷含量呈现上升趋势，而 CK 的有效磷含量则相对稳定且较低。图6a表明，在平谷试验田土壤中，P-BPS 添加量为 0.5% 时有效磷含量增长率为 29%；图6b显示，在校内试验田的土壤中，P-BPS 添加量为 0.5% 时，有效磷含量相较于种植前增加了 25%； 图6c显示，在青岛试验田的土壤中，P-BPS 添加量为 0.5% 时增长率为 24%。
图6P-BPS 添加前后对番茄土壤有效磷含量变化的影响
注：a 为平谷试验田，b 为校内试验田，c 为青岛试验田。
3 讨论
土壤磷素营养的缺乏限制着农业的生产，缺磷的主要原因是土壤中有效磷不足。研究表明，施加磷酸酶可增加土壤中有效磷含量[26]，进而能够促进农业生产。传统化学磷肥利用率通常较低，施入土壤后易与金属离子结合形成难溶性沉淀或被土壤颗粒吸附固定，不仅浪费磷资源，还可能导致土壤板结、水体富营养化等环境问题。而 P-BPS 通过生物酶作用持续缓慢释放有效磷，提高磷利用率，减少磷流失对环境的负面影响，更符合可持续农业发展要求。
3.1 P-BPS 对灭菌土壤的影响
从图2可以看出，灭菌处理能够减缓 P-BPS 的失活速率。高压灭菌会导致 DNA 降解和破碎[27]，还会对土壤表面积、孔隙度、电导率和土壤粒径分布等基本特性产生影响[28-29]，从而可能使土壤微生物群落结构、功能及多样性产生变化[30]。未来的研究应着重于评估 P-BPS 在不同施用频率和土壤环境条件下的长期稳定性和对土壤微生物群落结构与功能的潜在影响。
3.2 P-BPS 对土壤有效磷的影响
从图3来看，P-BPS 对不同磷含量的土壤有效磷增长率均有提升作用，其效果受土壤本身磷含量和 P-BPS 添加量的影响。这一现象表明，P-BPS 具有在不同磷素背景土壤中释放有效磷的能力。 P-BPS 能够显著提高土壤有效磷含量，主要是因为磷酸酶能够催化土壤中有机磷化合物的水解反应，将有机磷转化为无机磷（有效磷）[31]。图3中 48 h 后土壤有效磷含量增长速度平缓可能是因为在反应初期，土壤中有较多的可分解有机磷供磷酸酶发挥作用。随着反应的进行，可分解的有机磷逐渐减少，导致有效磷释放速度减慢。P-BPS 中的碱性磷酸酶能催化土壤中有机磷化合物水解，将其转化为无机磷（有效磷）。这是 P-BPS 提高土壤有效磷含量的关键机制。
3.3 P-BPS 对番茄植株生长的影响
已有学者对多种作物进行了长期跟踪研究，发现合理的磷素供应能够确保植物在整个生长周期内保持良好的生长态势，尤其是在多次施肥情况下，能够维持土壤中磷素的有效供给，满足植物不同生长阶段对磷的需求[32-33]。磷酸酶在植物的发芽过程中负责磷酸的降解，以获得植物发育和生长所需的磷酸盐[34-35]。在生殖生长阶段，充足的磷供应能够促进花芽分化和花器官的发育，增加花的数量和质量，从而提高坐果率。这一观点在 López-Bucio 等[36]的研究中得到了证实，他们发现磷在植物生殖生长过程中起着重要作用，尤其是在花芽分化和花器官形成阶段，并且这种促进作用直接反映在果实产量和质量上。据报道，磷还显著增加了印度芥菜幼苗的根和茎的长度[37]。图5中可以看出，P-BPS 对植株的高度有显著的影响。
4 结论
通过将碱性磷酸酶（PB）与多糖复合物（BPS） 结合得到 P-BPS。研究 P-BPS 的活性、在土壤中的稳定性、对土壤有效磷以及番茄植株生长的作用，得到以下结论：
（1）相较于 PB，P-BPS 在 20～65℃，pH 6～9 仍能保持 75% 以上的活性。
（2）经过灭菌和未灭菌土壤的孵育后发现， P-BPS 灭菌前和灭菌后的土壤悬浮物和溶液酶活性无明显变化，初步证明 P-BPS 不受土壤微生物影响。
（3）在对各地区添加 P-BPS 孵育 48 h 后发现， P-BPS 对土壤有效磷的增长作用与土壤含磷量有关，P-BPS 在添加量为 0.5%、孵育 48 h 后，土壤有效磷增幅最高可达到 49.5%。
（4）在种植番茄土壤中加入 P-BPS，番茄植株的主根长度、株高和植物主茎直径均显著增长。其中，株高增长最明显，在 P-BPS 添加量为 0.5% 时平谷区实验田番茄株高增幅为 116%，北京林业大学校内试验田增幅为 82%。
（5）在番茄生长周期添加 P-BPS，在 P-BPS 添加量为 0.5% 时，最终测得土壤的有效磷相较于种植番茄前平均增幅 28%。
综上所述，外源添加 P-BPS 显著提高了土壤中的有效磷含量，并促进了番茄植株的生长。应用 P-BPS 于土壤中，能够有效提高土壤的有效磷含量，改善土壤肥力，并促进植物生长。