摘要
旨在挖掘具有纤维素降解能力的细菌菌株，丰富羊粪堆肥功能菌剂的菌种资源。根据羊粪堆肥过程中的温度变化将其分为不同阶段，采集各阶段样本，通过 16S rRNA 测序分析优势菌群；分离筛选具有纤维素降解能力的菌株，选择最优菌株进行菌种鉴定并优化产酶条件，进行堆肥验证试验，评价实际效果。结果显示：羊粪好氧堆肥过程可分为 3 个阶段，即初始阶段 T1（第 0 d）、高温期 T2（1 ～ 12 d）、降温期 T3（13 ～ 35 d）。在堆肥过程中有 6 个优势菌群（变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线杆菌门、异常球菌和芽单孢菌门）的丰度呈现明显变化；相比于 T1、T3 期，T2 期变形菌门和厚壁菌门的丰度明显升高。试验分离出 30 株具有纤维素降解能力的菌株，经检测 11 株菌降解能力较好，其中 T2 期的菌株 G11 羧甲基纤维素（CMC）酶活性含量最高，鉴定为约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）。该菌株在 37℃、接种量 1%、初始 pH 8、培养 48 h 时 CMC 酶活性达到 （33.67±0.94）U/mL，较基础培养提高了 22.4%，堆肥试验表明，在施加原有菌剂的基础上加入该菌株，纤维素酶活性峰值增高，达到 94.49 U/g，漆酶活性同步增强。综上所述，筛选出的细菌 G11 具有较好的纤维素降解能力，可为羊粪堆肥菌剂的研发及应用提供理论依据。
Abstract
The aimed to explore cellulose-degrading bacterial strains from sheep manure composting to enrich the microbial resources of functional inoculants for sheep manure composting. According to the temperature changes during the composting process of sheep manure，it was divided into different stages，and samples were collected from each stage. The dominant microbial community was analyzed by 16S rRNA sequencing. Strains with cellulose degradation ability were separated and screened. The optimal strain was selected for strain identification and the enzyme production conditions were optimized. The composting validation experiment was conducted，and the actual effects were evaluated. The results showed that the aerobic composting process of sheep manure was divided into three stages：initial phase（T1，Day 0）， thermophilic phase（T2，Days 1-12）and cooling phase（T3，Days 13-35）. 16S rRNA sequencing revealed significant shifts in the relative abundances of six dominant phyla（Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Actinobacteria， Deinococcus-Thermus and Gemmatimonadetes）across these stages. Notably，Proteobacteria and Firmicutes exhibited marked enrichment during the T2 phase compared to T1 and T3 phase. Thirty cellulose-degrading strains were isolated，with 11 demonstrating superior activity. Strain G11，isolated from T2 phase，identified as Acinetobacter john sonin showed the highest carboxymethylcellulase（CMC）activity（33.67±0.94）U/mL under optimized conditions（37 ℃，1% inoculum，pH 8，48 h cultivation），representing a 22.4% improvement over the basal medium. Compost validation trials confirmed that supplementing the existing inoculant with strain G11 increased peak cellulase activity to 94.49 U/g，and enhanced laccase activity synergistically. The results highlighted the potential of strain G11 as a high-efficiency cellulose-degrading agent for accelerating sheep manure composting. This study provided a theoretical basis for developing multifunctional microbial inoculants in agricultural waste management.
好氧堆肥是目前禽畜粪污资源处理最主要的方式。经过堆肥处理的粪污有机肥施用于农田可以有效增加土壤养分含量，促进植物生长[1-3]。羊属于典型的草食性动物，其粪便中的纤维素难以降解，这严重制约了羊粪堆肥的应用[4]。
生物降解法是一种利用微生物菌群降解纤维素的方法[5]，羊粪堆肥的不同阶段有着不同的优势菌群。对羊粪堆肥过程进行分析，发现温度对细菌群落有显著影响[6]，微生物降解纤维素主要依靠纤维素降解酶[7]。不同微生物的产酶能力不同，从秸秆中筛选出 3 个纤维素降解菌，在 15℃时，其降解率有很大的差异[8]。
目前真菌被广泛的应用于秸秆饲料化[9-11]，但相较于真菌，细菌拥有适应能力强、繁殖速度快等特点，在 50℃极端温度仍具有较高的纤维素酶活性[12]。在粪污堆肥中，纤维素降解细菌菌种的筛选主要集中在食草动物胃肠内容物或自然环境等样本中[13-14]，对整体堆肥过程中菌落的研究筛选较少。相较于外源微生物，土著微生物经历了长期的自然选择过程，对堆肥原料有更好的分解与适应能力。因此，本研究将堆肥过程中不同阶段的羊粪作为研究对象，探究细菌菌落丰度变化，筛选具有良好纤维素降解能力的土著细菌，优化产酶条件，以期为羊粪好氧堆肥纤维素的降解利用提供新的细菌菌种资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
由新疆上品美羊科技有限公司提供的新鲜羊粪、复合菌剂（解淀粉芽孢杆菌∶细黄链霉菌∶里氏木霉），按照李豪等[15]的方法配置 LB 液体培养基、CMC-Na 培养基、赫奇逊液体培养基、产酶发酵培养基。
1.2 堆肥不同阶段细菌丰度变化
1.2.1 羊粪的处理
添加无菌水将羊粪含水量控制在 55%～65%，与复合菌剂（堆体质量 5%）均匀混合，记为原始处理组；条垛式堆制成长 2.5 m、宽 2 m、高 0.8 m 的堆体。每天测量粪堆温度 2 次，每 6 d 取样一次，置于-80℃冰箱待测。
1.2.2 羊粪 DNA 提取与 16S rRNA 测序
所有羊粪样品的 DNA 提取及 16S rRNA 扩增测序均由上海凌恩生物科技有限公司完成。
1.3 纤维素降解菌的分离纯化
1.3.1 菌种的富集培养
称取粪样 1 g 置于 50 mL 带有玻璃珠的三角瓶中，加入 10 mL 无菌水，恒温摇床 30℃、120 r/min 振荡 1 h 制成菌悬液，静置 30 min 后取上清液 0.5 mL 接种至 100 mL 液体培养基中，37℃、150 r/min 培养过夜。
1.3.2 纤维素降解菌的分离与纯化
将培养液梯度稀释，制备成不同浓度的菌悬液。取菌悬液涂布至羧甲基纤维素（CMC）钠平板上，37℃培养 24 h。选择形态不同且生长状态良好的菌落，接种到 LB 液体培养基中，37℃、120 r/min 培养 24 h，在 LB 平板上划线培养，直至分离出单菌落。
1.3.3 纤维素降解菌的筛选
取纯化过后的单菌落接种至 CMC-Na 液体培养基中 37℃培养做种子液。取种子液点种于羧甲基纤维素钠-刚果红平板上，37℃培养 2 d。选择出现清晰透明圈的平板，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算酶指数（EI 值），选取平均值较大的菌落[16]。
1.3.4 滤纸崩解试验
挑取初筛获得的单菌落接种到赫奇逊液体培养基中，加入 1 cm×6 cm 滤纸片，在 37℃，150 r/min 下培养 7 d，以不添加菌株作为空白组，定期观察滤纸片崩解情况。
1.4 微生物菌种鉴定
分离纯化后的菌种送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行靶向 DNA 测序鉴定。
1.5 纤维素酶活性测定
选取滤纸崩解良好的单菌落，接种于 CMC-Na 培养基中做种子液，在产酶培养基内加入 1% 接种量的种子液培养 24 h，于 4℃、8000 r/min 条件下离心 15 min，取上清液作为粗酶液备用。采用 3，5-二硝基水杨酸（Dinitrosalicylic acid DNS）法测定，用酶标仪测定波长为 540 nm 处的 OD 值并计算酶活性。
1.6 羧甲基纤维素酶的产酶条件优化
初始发酵条件设定为 CMC-Na 产酶发酵培养基，180 r/min 恒温摇床培养，37℃、接种量 1%、pH 7 培养 24 h。最适培养时间测定：设 12、24、 48、72 h 4 个梯度，其他条件不变；pH 的测定：设 6、7、8、9 共 4 个梯度，其他条件不变；培养温度的测定：设 30、37、43、50℃ 4 个梯度，其他条件不变；接种量的测定：设 0.5%、1%、2%、3% 4 个梯度，其他条件不变。分别测定各组 CMC 酶活性，酶活性检测方法同 1.5。对最优发酵方法进行 3 次验证试验，对比初始发酵条件，评价不同优化条件对菌种产酶的影响。
1.7 堆肥验证试验
羊粪的处理同 1.2.1，试验条垛分别记为处理组（原有菌剂 + 新筛选菌株）和对照组（不添加菌剂）。漆酶、纤维素酶使用对应的检测试剂盒根据说明书进行测定。
1.8 数据分析
数据使用 Excel 2021 进行记录整理，Graph Pad Prism 7.0 与 mega 进行作图。采用 SPSS 26.0 进行统计分析，采用 One-Way Anova analysis 方差分析和 Duncan 极差法对各组进行多重比较，结果用平均数 ± 标准差表示。
2 结果与分析
2.1 堆肥不同阶段细菌丰度变化
2.1.1 堆肥过程中温度的变化
如图1所示，羊粪堆肥过程中整体温度呈现先升高再降低的趋势。堆肥早期温度快速升高，第 4 d 达到峰值，最高温度为 61℃。第 13 d 降至 50℃ 以下。根据温度变化将堆肥过程分为 3 个阶段：初始阶段（T1）第 0 d，高温期（T2）第 1～12 d，降温期（T3）第 13～35 d。温度保持在 50℃以上 11 d，达到国家粪污无害化处理的标准[17]。
图1羊粪堆肥温度的变化
2.1.2 细菌丰度变化
如图2所示，堆肥过程中的不同阶段观察到 6 个有明显变化的细菌门，分别是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线杆菌门、芽单孢菌门和异常球菌。变形菌门是 T1、T2 期的优势菌门，相对丰度 >5%，随着堆肥进程的延长变形菌门丰度先增加后降低。厚壁菌门在 T2 期迅速增加后显著降低，T3 期厚壁菌门占比 <5%。拟杆菌门是 T3 期的优势菌门，随着堆肥进程的延长逐渐增加，T3 期相对丰度 >5％。
图2门水平上细菌的相对丰度
2.2 纤维素降解菌的分离纯化
2.2.1 纤维素降解菌的分离及形态学鉴定
从纯化平板上共挑取 30 个形态不同的菌落。如表1所示，纯化分离后编号分别为 S2-S6、G7-G18、J19-J31，其中 5 株从 T1 期分离获得，12 株从 T2 期分离获得，13 株从 T3 期分离获得。共分离获得革兰氏阳性菌 15 株，革兰氏阴性菌 15 株。
2.2.2 纤维素降解菌的筛选结果
对纯化得到的菌株进行产纤维素能力的筛查。如表2所示，除 S2、S3、G13、G14、J24-1、J29、J31 无透明圈呈现阴性反应，其余 23 株菌均可产生透明圈呈现阳性反应，其中 4 株菌的 EI 值大于 3。12 株菌对滤纸的降解效果良好，其中 G11、G16、J22、 J24-2、J25 的降解效果最好，滤纸崩解呈糊状。
2.3 羧甲基纤维素酶活性的测定
如图3所示，选择 EI 值较大与滤纸崩解效果良好的共 11 株菌进行 CMC 酶活性测定，G11、 G16、J22 的 CMC 酶活性显著高于其余 8 株菌株 （P<0.01），其中 G11 的 CMC 酶活性显著高于 G16、 J22（P<0.05），CMC 酶活性为 27.5 U/mL，为纤维素降解最优菌株，其次为 G16。
表1分离菌株形态特征、染色镜检与菌株来源结果
续表
注：G+ 为革兰氏阳性菌，G-为革兰氏阴性菌。
表2分离菌株 EI 值与滤纸崩解结果
注：+ 表示滤纸边缘膨胀出现毛边；++ 表示滤纸边缘溶解，但整体不成糊状；+++ 表示滤纸变形溶解，近似糊状。
图3株系的 CMC 酶活性
注：CMC 为羧甲基纤维素；柱中不同小写字母表示不同菌种间 CMC 酶活性差异显著（P<0.05）。下同。
2.4 菌株鉴定结果
如图4所示，对筛选得到的 G11 进行 16S rRNA 鉴定，基于 16S rDNA 基因的系统发育分析表明， G11 菌株与 Acinetobacter johnsonii（NR044975.1） 相似度达到 98.407%，鉴定为约翰逊不动杆菌 （Acinetobacter johnsonii）。
2.5 产酶条件优化
如图5A 所示，随着时间的增长，CMC 酶活性呈现先升高后降低的趋势，48 h 时酶活性最大，达到 30.45 U/mL。在 48 h 后酶活性呈现下降的趋势，结果表明，G11 的最佳培养时间为 48 h。如图5B 所示，在 pH 为 6、7 时，CMC 酶活性无显著差异。当 pH 为 8 时 CMC 酶活性显著提升，达到 32.5 U/mL。进一步提升 pH 值，则 CMC 酶活性显著降低，G11 的最适产酶 pH 值为 8。如图5C 所示，随着温度的升高，CMC 酶活性显著降低，当温度达到 50℃时，CMC 酶活性仅为 19.63 U/mL。在培养温度为 37℃时，CMC 酶活性最大，达到 32.15 U/mL。结果表明，G11 的最适产酶温度为 37℃。如图5D 所示，随着接种量的增加，CMC 酶活性有一定程度的降低，与 1% 接种量相比，在 3% 接种量时出现显著降低，除此之外，各组无显著差异。结果表明，G11 的最适接种量为 1%。CMC 酶活性为 28.48 U/mL。将培养条件设置为 37℃、接种 1%、pH 8、培养 48 h，重复 3 次验证 CMC 酶活性。结果表明，此条件下 CMC 酶活性达到（33.67±0.94）U/mL，相比较基础培养 CMC 酶活性增加了 22.4%。
2.6 验证试验
表3显示，处理组在堆肥过程中最高 LAC 活性为 （29.85±1.45）U/g，显著高于原始处理组和对照组 CK （P<0.05），处理组的最低 LAC 活性显著高于对照组 （P<0.05），与原始处理组相比降低了 1.67 U/g；处理组的最高 CL 活性为（94.49±2.27）U/g，显著高于原始处理组和对照组（P<0.05），处理组的最低酶活性显著高于对照组（P<0.05）。
图4基于 16S rRNA 基因序列的系统发育树
图5不同培养条件对 G11 菌株 CMC 酶活性的影响
表3漆酶、纤维素酶含量
注：不同小写字母表示同种酶各组别、各列之间酶含量差异显著（P<0.05）。
3 讨论
本研究发现，不同时期的核心细菌有所不同。其中厚壁菌门的相对丰度在高温期得到显著增长，在羊粪和小麦秸秆的混合堆肥中，厚壁菌门在分解期保持了较高的相对丰度，在腐熟期快速下降，这与本研究结果相同[6]。厚壁菌门的相对丰度在高温期快速增长，主要原因可能是厚壁菌门作为发酵细菌可以在高温期大量繁殖并形成孢子，进而在堆肥高温期有效地分解复杂化合物[18]。本研究发现，变形菌门是初始阶段和高温期的主要优势菌门，随着堆肥进程的延长呈现先升后降的趋势。在猪粪堆肥进程中，变形菌门的相对丰度会随着进程的增加逐渐降低[19]。在细菌领域内变形菌门是最大且表型最多样化的分支之一，变形菌门可以降解淀粉和纤维素等大分子多糖，这些多糖在堆肥过程中起着重要作用[20]，目前用来堆肥的变形菌门在堆肥过程中参与固氮与复杂有机化合物的分解[21-22]。本研究发现，羊粪堆肥过程中的主要分解时期是高温期，其主要的降解菌为厚壁菌门和变形菌门。通过研究甘蔗滤饼、家禽垫料和鸡粪等物料在堆肥过程中的细菌群落演替，各物料细菌群落结构有显著差异，并且初始物理化学差异会影响整个堆肥过程[23-24]。因此，研究羊粪堆肥过程中核心菌群的变化至关重要。
本研究筛选获得一株细菌菌株 G11，经鉴定为约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii），属于不动杆菌属。由于真菌具有良好的纤维素木质素降解能力，所以对于降纤维素菌种资源的开发多集中在真菌菌种。但是通过分析鸡粪和猪粪的菌群结构和动态变化，发现堆肥过程中真菌多样性的变化相较细菌更小，并且添加外源添加剂对真菌群落的影响大于细菌群落[25]。细菌拥有繁殖迅速、适应能力强等优点，对小尺寸的植物凋落物拥有更强的分解优势[26]。羊粪含有的纤维素类物质经过羊胃的消化，其形态得到改变，因此，粪便中纤维素类有机物的分解可能更依赖于细菌。而不动杆菌属细菌作为一类良好的异养硝化-好氧反硝化菌，广泛分布于水、土壤、污泥、废水和植物根际等生态系统中[26]，在台湾乳白蚁体内、动物粪便堆肥厂、猪粪和牛粪中均作为优势菌株被检出，并且部分菌株具有良好的纤维素降解、降抗、固氮和聚磷作用。目前针对其特殊的降解能力主要被应用于治理污水[27-31]。
本研究从堆肥过程中筛选土著细菌应用于堆肥。目前纤维素降解细菌的筛选大多集中在食草动物胃肠内容物或自然环境等样本中[13-14]，研究表明，运用土著微生物堆肥其环境适应性更佳，土著微生物经历了长期的自然选择过程，对堆肥原料中的复杂成分有更好的分解能力与适应能力。而从其他来源筛选的外源微生物缺乏这种长期适应性和选择性压力下的优化[32]。本研究筛选出的土著菌种与其他来源的外源菌相比适应能力更强，适应时间更短，可以更快地发挥分解能力推进堆肥进程。本研究在 37℃、接种量 1%、pH 8、培养 48 h 时，G11 具有较高 CMC 酶活性，达到（33.67±0.94）U/mL。从环境样本中筛选出的不动杆菌 XG，在最适条件下 CMC 酶活性仅为 25.49 U/mL[33]，从小熊猫粪便中筛选出的菌株 N2 的 CMC 酶活性为 2.21 U/mL[34]。与其他研究相比，G11 具有更高的 CMC 酶活性，能够更充分地降解纤维素。
本研究在施加原有菌剂的基础上添加 G11 进行堆肥验证，发现在堆肥过程中出现酶活性增强（CL 峰值 94.49 U/g），有效提升了纤维素酶活性，加速纤维素降解，验证了施加 G11 的实际应用价值。因此，可在后期的堆肥发酵中应用或与其他堆肥功能菌株复配作为复合菌系，提升羊粪堆肥的营养价值与品质。
4 结论
本试验在羊粪堆肥高温期样品中获得一株羊粪土著约翰逊不动杆菌 G11，在其最优产酶条件 （37℃、接种量 1%、pH 8、培养 48 h）下，具有良好的纤维素降解能力，堆肥结果表明，在原有菌剂的基础上添加 Acinetobacter johnsonii 可以延长高温期，有效降解纤维素；后续可对其固氮与解磷能力进行详细研究，作为多功能菌种资源应用于羊粪堆肥，优化堆肥进程。