摘要
为开发盐碱地生物肥料提供菌种资源，采用溶磷圈法从新疆盐碱土中分离得到 7 株溶磷菌，经液体溶磷试验，获得 1 株耐盐高效溶磷菌 PS4-1，经 16S rRNA 基因序列和系统发育树分析鉴定为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）。采用单因素和正交试验，对菌株 PS4-1 的发酵条件和溶磷能力进行分析。结果表明，菌株 PS4-1 种龄为 18 h，其在温度 40℃、pH 9.0 和盐浓度 5% 的条件下仍能较好生长，最佳发酵条件为温度 30℃、pH 7.0 和盐浓度 0.5%。菌株 PS4-1 对碳源的利用依次为麦芽糖 > 葡萄糖 > 蔗糖 > 淀粉 > 柠檬酸钠，对氮源的利用依次为氯化铵 > 蛋白胨 > 硫酸铵 > 尿素；最佳溶磷条件为麦芽糖 35 g/L，氯化铵 0.05 g/L，初始 pH 6.0，盐浓度 0.5%，接种量 3%，温度 35℃，在该条件下，菌株 PS4-1 对磷酸三钙的溶解量可达 480.23 mg/L，较优化前提升 41.79%。综上分析，霍氏肠杆菌 PS4-1 具有一定的耐高温、耐盐碱和良好的溶磷能力，可为盐碱地磷库的管理提供菌种资源。
Abstract
In order to provide strain resources for the development of bio-fertilizers in saline-alkali land，seven strains of phosphate-solubilizing bacteria were isolated from saline-alkali soil in Xinjiang by phosphate-solubilizing ring method. A salt-tolerant and efficient phosphate-solubilizing bacteria PS4-1 was obtained by liquid phosphate-solubilizing test. It was identified as Enterobacter hormaechei by 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree analysis. The fermentation conditions and phosphate solubilizing ability of strain PS4-1 were analyzed by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the strain PS4-1 could grow well under the conditions of temperature 40℃，pH 9.0 and salt concentration 5%. The optimum fermentation conditions were temperature 30℃，pH 7.0 and salt concentration 0.5%. The utilization of carbon sources by strain PS4-1 was maltose > glucose > sucrose > starch > sodium citrate，and the utilization of nitrogen sources was ammonium chloride > peptone > ammonium sulfate > urea. The optimal phosphate solubilization conditions were as follows ：maltose 35 g/L，ammonium chloride 0.05 g/L，initial pH 6.0，salt concentration 0.5%，inoculation amount 3%， temperature 35℃. Under these conditions，the dissolution amount of tricalcium phosphate by strain PS4-1 could reach 480.23 mg/L，which was 41.79% higher than that before optimization. In summary，Enterobacter hormaechei PS4-1 had certain temperature resistance，saline-alkali resistance and good phosphorus solubility，which could provide strain resources for the management of phosphorus pool in saline-alkali land.
磷（P）是植物生长发育的关键营养元素，也是构成核酸、磷脂、三磷酸腺苷（ATP）的组分，在营养物质转运、能量储存传递、信号传导等方面至关重要[1-2]。土壤中总磷含量丰富，但主要以难溶形式存在，仅有 0.1% 的总磷可被植物吸收；由于缺磷，目前作物产量仅为耕地生产力的 30%～40%[3]。磷酸盐（H2PO-4 或 HPO2-4）是植物吸收磷的主要形式，农业生产主要通过施用化学磷肥来解决耕地的磷素亏缺，满足作物的生长发育。然而，化肥中的磷酸根离子能与 Ca2+、Al3+、Fe3+ 等发生反应被固定于土壤中，影响磷肥的利用效率； 尤其是在盐碱土中，Na+、Ca2+ 强度效应导致土壤中磷的吸附增强，溶解度降低，作物仅能吸收化学肥料中 5%～25% 的磷，长期施用不仅造成磷矿资源的浪费，还会导致土壤结构破坏、肥力降低和农业面源污染[4-6]。因此，提升盐碱地土壤磷库的生物有效性对于减少化学磷肥的施用、促进盐碱地农业可持续发展具有重要意义。
土壤微生物在植物营养获取中起着关键作用，其中，溶磷菌可通过分泌有机酸、磷酸酶等代谢产物，溶解无机磷，矿化有机磷，将土壤中难溶性磷酸盐转化为可供植物吸收利用的有效磷，在低磷土壤中发挥着关键作用[7]。研究发现，溶磷菌耐受盐碱、高温等不利环境条件的能力，对于其在盐碱土壤中的生存及生物肥料中的应用都至关重要[8]。一些研究者探究了胁迫条件对磷酸盐溶解作用，如杨海霞等[9]、刘萍等[10]发现，从滨海盐碱地分离获得的盐单胞菌属 Y2R2 和泛菌属 RPB03 在一定温度、pH 和盐分胁迫下仍具有较强的溶磷能力。此外，源自盐碱土的耐盐溶磷菌不仅可以为植物提供磷源，提高土壤肥力，促进作物生长，还能改善土壤的理化性质，减轻盐分对作物的胁迫，进而提高作物生产力[11]。如 Adnan 等[12]发现，溶磷菌可以抵消土壤钙化对生物利用磷的拮抗作用，显著提高碱性土壤中有效磷的含量。Singh 等[13]通过田间试验也发现，接种草酸青霉菌可显著降低土壤 pH 和交换性钠含量，增加土壤有效磷含量，促进小麦、玉米生长。然而，溶磷菌施用效果受到菌株定殖、竞争能力和环境条件影响，Owen 等[14]发现，商业化的溶磷菌应用不同土壤环境时，其溶磷、促生效果差异较大，在环境中引入溶磷菌要能适应新的土壤环境，并在与土著微生物群落的竞争和合作中获取充足的营养。因此，需筛选适应区域环境的土著溶磷菌，其作为接种剂施用才具有更强的生存能力和根际定殖能力。新疆地处干旱与半干旱区，以石灰性土壤为主，土壤盐碱化面积逐年扩大，盐胁迫条件下，磷肥更易与钙形成难溶性磷酸盐，影响磷肥的利用效率[15]。因此，管理和维持磷的有效性是新疆盐碱地农业的主要挑战。基于此，本研究以新疆盐碱地植物根际土为研究对象，筛选出 1 株耐盐溶磷菌株，系统分析了该菌株的发酵及解磷条件，为开发新型微生物肥料，改善新疆盐碱地磷素供应提供菌种资源和依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 土壤样品
土壤样品取自新疆薰衣草、棉花、小麦地及未开垦的盐碱地植物根际，用铲子去除表层杂物，取 0～10 cm 根际土壤，充分混匀后，取 100 g 装于密封袋并编号，样品于 4℃冰箱保存。
1.1.2 培养基
改良 PVK 固体培养基（g/L）：葡萄糖 10， Ca3（PO4）2 5，（NH4）2SO4 0.5，NaCl 5，MgSO4 0.3， MnSO4·H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.03，0.4% 溴酚蓝，琼脂 18，pH 7.0～7.2。
LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，琼脂 25，NaCl10，pH 7.0～7.2。LB 固体培养基加琼脂 18。
改良 NBRIP 培养基[16]（g/L）：葡葡萄糖 10， Ca3（PO）2 5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.25，（NH4）2SO4 0.1 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0～7.2。
1.2 试验方法
1.2.1 溶磷菌的初筛
将盐碱土样混匀后，取 10 g 土样加入装有 90 mL 无菌水的锥形瓶中，于 30℃、120 r/min 涡旋振荡 30 min，静置直至液体分层，取 1 mL 上清液稀释至 10-4、10-5、10-6 浓度梯度，分别吸取 100μL 不同浓度稀释液，均匀涂布于改良 PVK 固体培养基上，置于 30℃培养 3 d，挑取呈现透明圈的不同菌落，在 PVK 培养基上进行划线纯化，将分离纯化的菌株编号，保存于 LB 固体培养基中，置于 4℃ 冰箱备用。将纯化的菌株点接至改良 PVK 培养基上，在 30℃培养 3 d，测量各菌株的溶磷圈直径 （D）和菌落直径（d）[17]，计算 D/d 来初步判定菌株的溶磷能力。
1.2.2 溶磷菌的复筛
活化初筛出的各菌株，接入 LB 培养基中，在30℃、120 r/min 的条件下培养 12 h，用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度至 OD600 值为 1.0，将菌液按 2% 的接种量接入 NBRIP 培养基中，以未接菌为对照，每个处理重复 3 次，于 30℃、120 r/min 培养 5 d，培养液 4000 r/min 离心 20 min 后，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量。
1.2.3 菌株 PS4-1 的鉴定及生长曲线
（1）分子生物学鉴定。将纯化后菌株 PS4-1 接种于 LB 固体培养基表面，于 30℃培养 24 h 后，用 DNA 提取试剂盒提取菌株的总 DNA，以通用引物 16S rDNA（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）的保守型序列为引物进行扩增，将扩增产物纯化回收后，送上海派森诺生物科技股份有限公司测序，将所得序列在 GenBank 数据库进行比对，并通过 NCBI 序列比对工具进行同源性分析，利用 MEGA 11.0 软件采用 Neighbor-Joining 法构建系统发育树，以确定菌株的种属归属，并构建菌株 PS4-1 的系统发育树。
（2） 菌株 PS4-1 的生长曲线。将保存菌株 PS4-1 划平板，于 30℃活化 24 h 后，挑取单菌落至 100 mL 的 LB 培养基中，在 30℃、120 r/min 的条件下培养，每隔 2 h 取样，测定培养液的 OD600 值，确定菌株的生长曲线。
1.2.4 菌株 PS4-1 发酵条件优化
将菌株 PS4-1 接入 LB 培养基中培养 18 h，用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度至 OD600 值为 1.0，将菌液以 1% 的接种量投加至 LB 培养基中，分别调节温度（20～40℃）、pH（4～9）、盐浓度（0%～5%），以不接菌为对照，每个处理重复 3 次，于 120 r/min 振荡培养 24 h，测定发酵液的 OD600 值。
1.2.5 菌株 PS4-1 溶磷条件优化
（1）碳、氮源的优化。将菌株 PS4-1 接入 LB 培养基中培养 18 h，用无菌水重悬菌体，调节菌液浓度至 OD600 值为 1.0，将菌液以 2% 的接种量，分别投加至以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、柠檬酸钠为唯一碳源的 NBRIP 培养基中，培养基其他成分不变，以未接菌为对照，每个处理重复 3 次，于 30℃，120 r/min 振荡培养 4 d，培养液 4000 r/min 离心 20 min 后，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量，确定最适碳源，在此基础上优化碳源浓度（5～40 g/L）。在确定碳源及浓度的基础上，以尿素、蛋白胨和氯化铵分别替代 NBRIP 培养基中的氮源，试验过程与碳源优化一致，考察不同氮源对菌株 PS4-1 溶磷能力的影响，并优化氮源浓度（0.05～0.4 g/L）。
（2）正交试验。在优化碳、氮源基础上，以温度、pH、盐浓度、接种量为影响因素，单因素试验结果为各因子水平，采用 L16（44）设计正交试验 （表1），优化菌株 PS4-1 溶磷条件。以不接菌处理为对照，每个处理 3 次重复，各处理均在 120 r/min 培养 5 d 后，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量。
表1正交试验设计
注：A 为温度（℃），B 为 pH，C 为盐浓度（%），D 为接种量（%）。
1.2.6 数据处理
用 Excel 2010 进行数据处理，SPSS 26.0 进行相关统计分析，Origin 2021 作图。
2 结果与分析
2.1 溶磷菌的筛选
2.1.1 初筛
将已纯化的单菌落接至改良 PVK 培养基上，在 30℃培养 3 d 后，共筛选出 7 株能产生明显溶磷圈的菌株，命名为 PS1-1、PS1-2、PS4-1、PS4-2、PS5-1、PS7-1、PS7-2。其中有 3 株菌透明圈较大，菌株 PS4-1 产生的 D/d 值最大，约为 2.27；菌株 PS1-2 的 D/d 值约为 1.20； 菌株 PS7-1 的 D/d 值为 1.87。由 D/d 值可初步分析出菌株 PS4-1 的解磷能力最好，但仍需要通过复筛来确定各菌株的解磷能力。
2.1.2 复筛
将初筛获得的 7 株溶磷菌在 NBRIP 培养基中进行复筛，其解磷效果见图1。7 株菌对磷酸钙的溶解能力大小依次为菌株 PS4-1>PS7-1>PS7-2>PS5-1>PS1-2>PS1-1>PS4-2。菌株 PS4-1 的溶磷量最高，为 295.16 mg/L，解磷能力显著高于其他菌株（P<0.05）。因此，选定菌株 PS4-1 进行后续试验。
2.2 菌株 PS4-1 鉴定与生长曲线
2.2.1 16S rDNA 基因序列分析
将菌株 PS4-1 的 16S rDNA 序列与 GenBank 核酸数据库中其他菌种进行对比，通过 MEGA11.0 软件构建菌株 PS4-1 的系统发育树，见图2。由图2可知，菌株 PS4-1 和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）位于同一分支，同源性达到 99.43%，鉴定菌株 PS4-1 为霍氏肠杆菌。
图1菌株的溶磷效果
注：不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P<0.05）。下同。
2.2.2 菌株 PS4-1 的生长曲线
为明确菌株群体生长规律和特征，为优化培养条件提供优质菌种资源，测定了溶磷菌 PS4-1 的生长曲线。由图3可见，菌株 PS4-1 适应能力强，延滞期较短；在 2～18 h 吸光度值迅速上升，表明菌株 PS4-1 进入对数期，细胞快速增殖；在 20～32 h，吸光度值趋于稳定，说明菌株 PS4-1 处于稳定期； 而在 32 h 后，吸光度值不断降低，表明死亡率大于新生率，菌株 PS4-1 进入衰退期。由于菌株在对数期后期增殖速度快，适应能力较强，抗外界冲击能力较好，因此，选取 18 h 作为菌株 PS4-1 的种龄。
2.3 菌株 PS4-1 的发酵条件
2.3.1 温度
温度对溶磷菌的生长具有显著影响，适宜的温度可以促进溶磷菌的生长和代谢，而过高或过低的温度则会抑制其生长。温度对菌株 PS4-1 生长的影响如图4所示。由图4可知，菌株 PS4-1 的 OD600 值均大于 0.5，且随温度升高，呈现出先上升后下降的趋势，差异显著（P<0.05），表明菌株 PS4-1 在 20～40℃的温度范围内均能生长。当温度在 30～40℃时，菌株 PS4-1 的 OD600 值均高于 1.5，高于 20～25℃，表明菌株 PS4-1 具有一定的耐高温特点，更能适应本地气候，具备生物肥料制备的耐温要求。
图2菌株 PS4-1 系统发育树
图3菌株 PS4-1 的生长曲线
2.3.2 pH
pH 可通过影响细胞酶活、能量代谢、营养物的解离与吸收等方式间接影响微生物的生长，确定合适的 pH 有利于提高发酵效率。在温度为 30℃ 时，通过摇瓶发酵试验，考察了 pH 对菌株 PS4-1 生长的影响。由图5可见，菌株 PS4-1 具有一定的耐碱性，在 pH 6.0～9.0 范围内均能良好生长，而当 pH 下降至 4～5 时，其生长明显受阻，这可能与其源自新疆盐碱土壤有关。
图4温度对菌株 PS4-1 生长的影响
2.3.3 盐浓度
盐可以通过改变土壤溶液的渗透压影响微生物的生长。盐浓度对菌株 PS4-1 的生长影响如图6所示。随着 NaCl 浓度的增加，菌株 PS4-1 的 OD600 值出现先升高后下降的趋势，除 NaCl 浓度 0.5% 和 5%，其他无显著差异（P>0.05）。菌株 PS4-1 的 OD600 值均大于 1.0，说明菌株 PS4-1 在 0%～5% 的盐浓度范围内均能良好生长，这可能与菌株 PS4-1 从新疆盐碱土中分离，具有一定的耐盐性有关。综上所述，菌株 PS4-1 的最适发酵条件为温度 30℃、pH 7.0、盐浓度 0.5%。
图5pH 对菌株 PS4-1 生长的影响
图6盐浓度对菌株 PS4-1 生长的影响
2.4 菌株 PS4-1 溶磷条件优化
2.4.1 碳源的优化
碳源对菌株 PS4-1 溶解磷酸三钙的效果表现出明显差异。结果如图7A 所示，不同碳源情况下，菌株 PS4-1 溶磷量大小排序依次为麦芽糖 >葡萄糖 >蔗糖 >淀粉 >柠檬酸钠。以麦芽糖和葡萄糖作为碳源时，溶磷量均在 300 mg/L 以上，显著高于其他碳源（P<0.05）。其中，以麦芽糖为碳源时菌株 PS4-1 的溶磷能力最强，溶液中溶磷量达 357.79 mg/L。而当柠檬酸钠为碳源时，菌株 PS4-1 的溶磷效果最差，溶磷量仅为 63.34 mg/L，这可能是因为柠檬酸钠的代谢过程涉及较为复杂的生化路径，菌株 PS4-1 难以有效利用。
在此基础上，以麦芽糖作为溶磷碳源，探究碳源浓度梯度对 PS4-1 溶磷效果的影响。溶磷量随麦芽糖浓度增加呈先上升后下降的趋势 （P<0.05），在 35 g/L 时达到峰值，而浓度过高时溶磷量下降，表明碳源浓度通过代谢调控显著影响菌株溶磷效率，因此，选取菌株 PS4-1 溶磷最适麦芽糖浓度为 35 g/L。
2.4.2 氮源的优化
氮是微生物生长所需的重要营养元素，对溶磷菌的生长、溶磷能力有着明显影响。由图8A 可知，该菌株利用不同氮源的优先顺序排列为氯化铵 >蛋白胨 >硫酸铵 >尿素。以氯化铵和蛋白胨为氮源时，溶磷量均超过 300 mg/L，显著高于其他氮源（P<0.05）。其中以氯化铵为氮源时溶磷量最高；以尿素为氮源时溶磷量最低，这表明该菌更容易以氯化铵为氮源转化磷酸三钙。
图7碳源对菌株 PS4-1 溶磷的影响
优化碳、氮源的基础上，考察氯化铵浓度对菌株 PS4-1 溶磷能力的影响，结果见图8B。由图可知，菌株 PS4-1 的溶磷量随着氯化铵浓度的升高呈现出逐步下降的趋势，且各浓度梯度间差异显著（P<0.05）。当氯化铵浓度为 0.05 g/L 时，菌株 PS4-1 溶磷量最高，为 430.31 mg/L，菌株 PS4-1 溶磷最适的氯化铵浓度为 0.05 g/L。
2.4.3 正交试验
依据优化后的碳、氮源，对菌株 PS4-1 进行 4 因素 4 水平正交试验，优化溶磷条件，结果见表2。由 K 值和极差 R 值大小可知，环境与生物因素对菌株 PS4-1 溶磷效果的影响顺序为 pH>温度 >盐浓度 >接种量。菌株 PS4-1 的最优溶磷条件为 pH 6、温度 35℃、盐浓度 0.5% 和接种量 3%。验证试验表明，该优化方案可使菌株 5 d 内溶磷效能提升至 480.23 mg/L。
图8氮源对菌株 PS4-1 溶磷的影响
表2L16（44）正交试验结果
注：A 为温度（℃），B 为 pH，C 为盐浓度（%），D 为接种量（%）。
3 讨论
在植物必需的营养元素中，磷是在植物体内吸收、运输和分配受到盐胁迫不利影响的营养元素[18]。在盐碱土中，磷肥的利用效率低，限制了土壤磷素的有效性，利用盐碱地土壤中的难溶性磷是提高土壤有效磷含量的关键。在耐盐微生物群落中，耐盐溶磷菌被认为是重要的根际促生菌之一，可以将土壤中难溶性磷转化为生物可利用磷，在减轻盐害的同时提高土壤肥力，促进作物生长[19-20]。目前，国内外报道的耐盐溶磷菌主要有泛菌属、气球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、节杆菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、产碱杆菌属、微杆菌属、无色杆菌属[21]。本研究中筛选获得菌株 PS4-1，经初步鉴定为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei），并且在同属中具有良好的溶磷能力。
研究表明，筛选自盐碱环境下的溶磷菌仍能在高盐条件下维持其溶磷活性。本研究中筛选的菌株 PS4-1 来自于新疆盐碱地，在 0%～5% 的盐浓度范围内均能生长，溶磷量可达 295.16～418.52 mg/L。范延辉等[22]从黄河三角洲地区分离得到的菌株 PSB7 在 5～35 g/L 的 NaCl 液体培养基中生长良好，溶磷量为 72.26 mg/L；王宏燕等[23]从黑龙江省齐齐哈尔市盐碱土壤中筛选耐盐碱解磷细菌 P-W13，在 10% 的 NaCl 盐分浓度和 pH 为 10 时仍表现较强解磷能力，该菌株在培养 144 h 时解磷能力最强，为 89.86 mg/L；王君等[24]从黄河三角洲地区盐碱化耕地筛选得到的菌株 B19 最高可耐受的盐浓度达 6%，溶磷量可达 230.21 mg/L。与上述耐盐解磷菌相比，本研究中的菌株 PS4-1 具有较强的溶磷能力。
溶磷菌对碳源、氮源的利用能力存在差异，在溶磷过程中产生的不同的有机酸，进而影响溶磷效果[25-27]。李思思等[28]分离出的假单胞菌 1616X1 经优化后，以葡萄糖和硫酸铵为碳、氮源，较优化前溶磷量提高了 17.26%；韦宜慧等[29]分离的菌株 P5，优化培养条件后，其溶磷能力为 268.69 mg/L； 魏畅等[30]筛选出的弯曲芽孢杆菌 W6，碳源为木糖、氮源为硝酸钾时，溶磷量最大，为 368 mg/L。本试验中菌株 PS4-1 以麦芽糖和氯化铵为碳、氮源，经条件优化后溶磷量可达 480.23 mg/L，其解磷能力超过了上述报道的菌株，该菌株具有良好的耐高温、耐盐碱特性，有潜力成为提升盐碱地有效磷含量及改良新疆盐碱地的优良菌种资源。后续将对溶磷菌 PS4-1 在盐碱土壤中的存活、定殖及溶磷效果等方面进行研究，为新疆盐碱地农业可持续发展提供理论与技术支撑。
4 结论
从新疆盐碱地植物根际土壤中筛选出7株溶磷菌，其溶磷能力在 65.06～295.16 mg/L。菌株 PS4-1 的溶磷能力最优，经鉴定为霍氏肠杆菌 （Enterobacter hormaechei），该菌株具有一定的耐高温、耐盐碱性和良好的溶磷能力，其对碳源的利用为麦芽糖 >葡萄糖 >蔗糖 >淀粉 >柠檬酸钠，对氮源的利用为氯化铵 >蛋白胨 >硫酸铵 >尿素，在麦芽糖 35 g/L、氯化铵 0.05 g/L、温度 35℃、初始 pH 6.0、接种量 3%、盐浓度 0.5% 最优溶磷条件下，菌株 PS4-1 对磷酸三钙的溶磷量可达 480.23 mg/L，在盐碱地改良和微生物菌肥开发中具有较好的应用潜力，这些研究结果将为今后 PS4-1 的扩繁与田间应用提供重要参考，为新疆盐碱地磷素可持续利用和农业生态环境的改善提供有力支持。