摘要
为明确枝条覆盖对梨园土壤微生态的影响，解析土壤及微生物在连续多年枝条覆盖下的垂直变化特点，通过研究枝条覆盖（5 年）土壤在 0 ～ 10、10 ～ 20、20 ～ 30、30 ～ 40、40 ～ 50 cm 的 5 种不同深度下的理化性质特点，并利用 PacBio 平台对细菌、真菌进行三代全长扩增子测序分析。其结果如下：（1）枝条覆盖有提高土壤肥力的作用，土壤浅层的有机质、碱解氮含量提升明显，增加 50% 左右，且随着土层深度的增加影响逐渐减弱； （2）枝条覆盖能提高微生物多样性，智能调节微生物丰度，提高微生物的均匀度；（3）土壤微生物在门水平上主要由变形菌门（Proteobacteria）和子囊菌门（Ascomycota）构成，占比 34.00% 以上，属水平上主要由朱氏杆菌属（Chujaibacter，占比 11.00% 以内）和假散囊菌属（Pseudeurotium，占比 45.00% 以内）组成，种水平上主要由 Paraburkholderia_sartisoli（占比 5.00% 以内）和 Pseudeurotium_sp（占比 45.00% 以内）组成，且在枝条覆盖下各土层相对丰度均低于地布覆盖，枝条覆盖对真菌丰度的影响程度大于细菌；（4）细菌功能主要为代谢（占比 46.00% 以上），真菌功能主要为腐生生物（占比 29.00% ～ 61.00%），均与主要门类呈极显著相关关系；枝条覆盖对细菌功能影响较小，对真菌功能影响较大。综上，枝条覆盖作为行内土壤管理一种新途径，对废旧枝条利用、提高土壤养分、平衡土壤微生物群落有重要作用，为后续枝条覆盖的研究与应用提供参考。
Abstract
In order to clarify the impact of branch covering on soil microbiology in pear orchards and to analyze the vertical change characteristics of soil and microorganisms under continuous years of branch covering，the characteristics of physicochemical properties of branch covered（5 years）soil at five different depths of 0-10，10-20，20-30，30- 40，and 40-50 cm were investigated and three generations of full-length amplicon sequencing of bacteria and fungi were analysed using the PacBio platform. The results were as follows：（1）Branch mulching significantly enhanced soil fertility， particularly in the shallow layer，where organic matter and alkali-hydrolyzable nitrogen content increased by approximately 50%. This effect diminished with increasing soil depth；（2）Branch covering improved microbial diversity，intelligently regulated microbial abundance，and improved microbial uniformity；（3）Soil microorganisms at the phylum level were mainly composed of Proteobacteria and Ascomycota，accounting for over 34.00%，and at the genus level mainly composed of Chujaibacter（<11.00%）and Pseudeurotium（<45.00%），and at the species level mainly composed of Paraburkholderia_sartisoli（<5.00%）and Pseudeurotium_sp（<45.00%），and the relative abundance of each soil layer under branch cover was lower than that of the control，branch covering had a greater effect on fungal abundance than bacterial；（4）Bacterial function was predominantly Metabolish（>46.00%）and fungal function was predominantly Saprotroph（29.00%-61.00%）， both with highly significant relationships to major phyla. Branch covering had a lesser effect on bacterial function and a greater effect on fungal function. In conclusion，branch covering，as a new way of soil management in rows，had an important role in solving waste branches，improving soil nutrients and improving soil microbial community，which could provide reference for subsequent research and application of branch mulching.
Keywords
梨树栽培范围广、面积大，其每年修剪产生大量废弃枝条，处理难度大，且部分用于焚烧，严重污染环境。而枝条中富含有机、无机营养，若加以利用，则可解决废弃枝条难处理问题。土壤管理是梨园管理必不可少的措施之一。目前，梨园行内土壤管理模式主要为清耕、地布覆盖等模式。其中清耕模式因费时费工正在逐渐被地布覆盖取代，而地布覆盖也存在旧地布处理困难、易污染环境等问题。现阶段，枝条覆盖因能将果园修剪后的废弃枝条再利用，可解决废弃枝条处理难、清耕易造成土壤板结及地布易造成环境污染等问题，逐渐引起科研工作者的兴趣，相应研究也逐渐增多。
其中，葡萄碎枝条行内覆盖可改善葡萄园小气候，保持土壤水分，减少杂草生长，提高土壤养分含量、酶活性[1-2]。然而，葡萄枝条覆盖虽对可溶性固形物影响较小，但提高了可滴定酸含量，糖酸比降低[3]。有研究指出，虽然果树的夏季和冬季修剪枝条覆盖后均能提高土壤水分含量，但夏季枝条在改善土壤理化性质和提高酶活性时更有优势，在修剪后可直接覆盖不需剪段，而冬季修剪的枝条修剪后宜粉碎后覆土[4]。且当枝条与粪肥混施覆盖于土壤表面时，能互相促进分解，提高胞外酶活性，有利于提前萌芽，提高土壤储水量[5-7]。然而，因根皮苷大量存在于苹果的枝条中，苹果枝条覆盖后，其土壤中的根皮苷随着时间的增加含量逐年提高，当达到 7.58 mg/kg 时便会抑制树体生长，降低叶片光合速率[8]。除此之外，对线粒体的呼吸代谢也有一定的抑制作用，在覆盖时最好粉碎还田[9]。与此相似，杨树枝条覆盖短期促进小麦生长，长期可能会导致养分缺乏，从而抑制植物生长[10]。
土壤微生物是所有陆地生态系统中最重要和最复杂的组成部分之一，在土壤-植物系统中起着关键作用，对养分循环和碳储存至关重要[11-14]。覆盖作为重要的土壤管理模式对土壤微生物影响显著。与无覆盖作物相比，覆盖作物可以通过提高微生物群落丰度来改善土壤[15]。其中，梨园枝条覆盖虽对细菌多样性影响较小，但对变形菌门、绿弯菌门等有一定调节作用，且改变了部分目水平的优势种群；当枝条覆盖量为 4 kg/ 株，更有利于改善土壤酸化，提高梨果实品质[16-18]。枝条覆盖后虽碳源利用率较高，但同时增加了土壤微生物群落不稳定性及真菌量，而大部分病菌一般为真菌，增加的真菌带来的病害是否增多还有待进一步研究[19]。除此之外，有人对杨树枝条进行翻埋和覆盖处理，结果显示，两种方法虽均能改善土壤理化性质，但将翻埋和覆盖结合相对于单独处理更能改善土壤质量，提高菌根真菌的活性[20-21]。当将枝条覆盖和秸秆覆盖在葡萄园中做对比发现，两者均能提高土壤养分，秸秆覆盖更能改善土壤性质、提高微生物多样性，枝条覆盖则在减少土壤温差、提高果实品质更优[22-23]。但进行枝条覆盖其降解速率较低，因此，有研究将微生物菌剂添加到枝条中，发现不仅能加快枝条的腐熟，还能更好地改良土壤，促进树体发育[24]。
综上，目前，枝条覆盖的研究主要集中在不同种类和不同覆盖方式对土壤的影响，对不同深度土壤的影响研究较少。除此之外，大部分研究的覆盖年限也较短，一般均为 2～3 年，并不能全面解析其对土壤微生态的影响。因此，为全面了解枝条覆盖对土壤微生态的影响，本研究通过对 5 年枝条覆盖下 5 种不同深度土壤的理化性质及细菌、真菌的微生物群落垂直变化进行探究，以期为枝条覆盖的长期适用性提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 试验设计与样品采集
试验地位于河北省秦皇岛市昌黎县河北省农林科学院昌黎果树研究所孔庄示范基地梨园 （39°42′34″N，119°5′49″E），栽培密度 4 m×1 m，栽培品种为‘雪青’，土壤质地为黏土。枝条覆盖（BC）自 2019 年初实施，将梨树修剪掉的枝条粉碎成 2～5 cm 小段，枝条覆盖厚度为 15 cm，通过体积法计算重量约为 15 kg/m2，宽度为 100 cm （树干左右各延伸 50 cm），覆盖于行内；对照为园艺地布覆盖（GC），在行内（树干左右各 50 cm） 铺设园艺地布。见图1。于 2023 年 8 月 24 号进行土壤样品采集，采样位置为行内，采用“S”形取样法。分别在距离树干 50 cm 取样，地布覆盖和枝条覆盖各采集 5 个点，每个点采集 5 个深度 （0～10、10～20、20～30、30～40、40～50 cm）。每个深度采完后混合并均匀分成两份，一份风干用于土壤有机质、碱解氮、脲酶等理化性质测定，一份存于-80℃用于后续送往诺禾致源公司进行土壤细菌、真菌微生物测定。
图1试验设计
1.2 样品测定
土壤理化性质测定方法：土壤脲酶采用 NH4 + 释放量法测定，土壤过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定[25]。土壤有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定，土壤碱解氮含量通过碱解扩散法测定，土壤有效磷含量通过钼锑抗比色法测定，土壤速效钾含量通过乙酸铵提取-火焰光度法测定[26]
土壤细菌、真菌测定：首先通过常规方法对土壤 DNA 进行提取扩增，其中细菌引物为 27F（5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′）和 1492R （5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′）；真菌引物为 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和 ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[27]。之后进行文库构建并用 PacBio 平台进行测序。下机数据通过整理校正后，以 97% 一致性将序列聚类并进行物种注释。最后对数据均一化处理，并进行多样性、功能预测（Tax4Fun、FunGuild）等分析。
1.3 数据分析
土壤理化性质采用 SPSS 20.0 进行分析，土壤微生物采用诺禾云平台进行分析（https：//magic.novogene. com/customer/main#/loginNew）。土壤理化性质与微生物相关性采用 SPSS 20.0 进行分析。菌群与环境因子之间的关系采用典型相关分析（CCA）。细菌、真菌差异物种分析采用线性判别分析效应量分析（LEfSe） 方法，线性判别分析（LDA）值设置为 4[28]。
2 结果与分析
2.1 土壤理化性质
为了明确长期枝条覆盖对土壤理化性质的影响，对枝条覆盖下 5 种深度的土壤进行了理化性质测定，其结果显示，随着土壤深度的增加，地布和枝条覆盖均呈现土壤理化性质指标下降的趋势，且枝条覆盖的下降趋势总体比地布覆盖缓慢。这说明枝条覆盖能弱化土层深度带来的土壤理化性质差异，使不同土层的土壤养分差距缩小，这样有利于减小果树根系的上浮，保证根系的正常生长。在同土层中，枝条覆盖的理化性质指标大部分高于地布覆盖。这说明，枝条覆盖对土壤理化性质有积极影响，提高了各土层有机质、有效磷等的养分含量，尤其在浅土层中效果尤其显著（图2）。其中，同土层下与地布覆盖相比，枝条覆盖下土壤中 0～10、20～30 cm 土层的有机质分别相对地布覆盖升高 47.80%、66.67%，0～10 cm 土层的碱解氮相对地布覆盖升高 66.20%，20～30 cm 土层的有效磷相对地布覆盖升高 27.46%，20～30、 30～40 cm 土层的速效钾分别相对地布覆盖升高 57.75%、55.92%，10～20、20～30 cm 土层的土壤脲酶分别相对地布覆盖升高 88.84%、122.47%，且均显著高于同土层的地布覆盖（P<0.05）。仅过氧化氢酶在 40～50 cm 土层出现了低于地布覆盖 19.61% 的情况，分析可能由深层土壤环境导致。整体可见，枝条覆盖对不同深度的土壤理化性质均有有益的影响。且随着覆盖时间的增加，影响程度逐渐增加，不断提高土壤养分，促进梨树生长发育。
图2土壤理化性质
2.2 土壤微生物多样性
由图3可知，枝条覆盖相对地布覆盖多样性指数普遍偏高，随着土壤深度的增加，多样性指数均呈逐渐下降的趋势。Shannon 指数和 Simpson 指数趋势走向基本相同，其枝条覆盖多样性指数较地布覆盖有部分提高，主要体现在 10～20 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 7.44%；Simpson：相对地布覆盖升高 0.47%）、20～30 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 5.67%；Simpson：相对地布覆盖升高 0.17%）、 30～40 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 5.57%； Simpson：相对地布覆盖升高 0.30%）土层。Chao1 指数和 Ace 指数趋势走向基本相同，其多样性指数的提高主要体现在 0～10 cm（Chao1：相对地布覆盖升高 35.89%；Ace：相对地布覆盖升高 41.92%） 和 30～40 cm（Chao1：相对地布覆盖升高 41.41%； Ace：相对地布覆盖升高 41.61%）。其中较特殊的为 Chao1 和 Ace 指数，在 30～40 cm 土层均显现出骤然升高的趋势，与 0～10 cm 土层指数几乎持平。其中 Shannon 和 Simpson 指数在枝条覆盖中其 0～10 cm 与 40～50 cm 差异性显著（P<0.05），而在地布覆盖中 0～10 cm 与 40～50 cm 无差异，说明枝条覆盖对浅土层影响较大。
图3土壤细菌多样性
由图4可知，真菌多样性均随着土壤深度的增加呈现下降的趋势。Shannon 指数和 Simpson 指数变化趋势相同，且各个土层深度其枝条覆盖整体整体比地布覆盖指数高，其中 Shannon、Simpson 指数均在 10～20 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 10.12%；Simpson：相对地布覆盖升高 2.45%）、 20～30 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 20.00%； Simpson：相对地布覆盖升高 6.72%）、30～40 cm（Shannon：相对地布覆盖升高 17.70%；Simpson：相对地布覆盖升高 7.10%）土层差异相对较大，而 Simpson 指数差异相对 Shannon 较小，控制在 7.00% 内。而 Chao1 指数和 Ace 指数各土层枝条覆盖相对地布覆盖的差距表现在 0～10 cm（Chao1：相对地布覆盖降低 12.96%；Ace：相对地布覆盖降低 12.23%）、10～20 cm（Chao1：相对地布覆盖升高 5.50%；Ace：相对地布覆盖升高 4.53%）、20～30 cm（Chao1：相对地布覆盖降低 19.11%；Ace：相对地布覆盖降低 17.87%）、30～40 cm（Chao1：相对地布覆盖升高 11.56%；Ace：相对地布覆盖升高 7.79%）和 40～50 cm（Chao1：相对地布覆盖升高 43.10%；Ace：相对地布覆盖升高 44.97%），其枝条覆盖和地布覆盖有互有指数略高的情况。与细菌多样性类似，真菌中，Shannon、Simpson 指数趋势相同，Chao1、Ace 指数趋势相同。
图4土壤真菌多样性
2.3 微生物群落结构组成
由图5a可知，枝条覆盖和地布覆盖的各土层细菌门类主要为变形菌门（Proteobacteria，占比 34.79%～44.93%）、酸杆菌门（Acidobacteria，占比 15.75%～31.56%） 和拟杆菌门（Bacteroidetes，占比 5.05%～10.69%），前 3 物种总占 64.02%～74.08%。其中，变形菌门各土层在枝条覆盖的占比整体小于地布覆盖，具体为 0～10 cm 较地布覆盖减少 2.95%、10～20 cm 较地布覆盖减少 4.42%、20～30 cm 较地布覆盖减少 8.72%、 30～40 cm 较地布覆盖增加 0.12%、40～50 cm 较地布覆盖减少 8.12%。拟杆菌门随土层深度的增加逐渐增加，且枝条覆盖下的拟杆菌门相对地布覆盖变化：0～10 cm 较地布覆盖减少 2.03%、10～20 cm 较地布覆盖增加 1.75%、20～30 cm 较地布覆盖增加 4.72%、30～40 cm 较地布覆盖减少 0.37%、 40～50 cm 较地布覆盖增加 2.68%。酸杆菌门在枝条覆盖的占比稍高于地布覆盖，即 0～10 cm 较地布覆盖增加 4.18%、10～20 cm 较地布覆盖增加 0.31%、20～30 cm 较地布覆盖增加 2.93%、 30～40 cm 较地布覆盖增加 0.95%、40～50 cm 较地布覆盖增加 8.73%，这说明门水平上枝条覆盖对细菌群落的均匀度起到一定的作用。
在属水平上，主要由朱氏杆菌属（Chujaibacter，占比 0.88%～10.47%）、芽孢杆菌属 （Bacillus，占比 1.39%～4.89%）和未鉴定伯克氏菌属（unidentified_Burkholderiaceae，占比 0.68%～4.88%）组成，总占比为 3.44%～16.55%。其中，朱氏杆菌属随土层深度的增加呈增加趋势，且枝条覆盖的比例整体明显低于地布覆盖，其中， 0～10 cm 较地布覆盖增加 0.51%、10～20 cm 较地布覆盖减少 6.02%、20～30 cm 较地布覆盖减少 4.61%、30～40 cm 较地布覆盖减少 6.18%、40～50 cm 较地布覆盖减少 5.01%。芽孢杆菌属随土壤深度增加亦呈现增加趋势，其相对丰度经枝条覆盖后浅层呈一定的增加，其相比地布覆盖的变化：0～10 cm 较地布覆盖增加 0.67%、10～20 cm 较地布覆盖增加 0.09%、20～30 cm 较地布覆盖增加 0.61%、 30～40 cm 较地布覆盖减少 3.15%、40～50 cm 较地布覆盖减少 1.32%。未鉴定伯克氏菌属随土层增加出现降低的趋势，且同土层枝条覆盖相对丰度低于地布覆盖，其中，0～10 cm 较地布覆盖减少 0.61%、10～20 cm 较地布覆盖减少 1.61%、 20～30 cm 较地布覆盖减少 0.36%、30～40 cm 较地布覆盖减少 0.01%、40～50 cm 较地布覆盖减少 0.92%（图5b）。其中朱氏杆菌属、未鉴定伯克氏菌属属于变形菌门，芽孢杆菌属属于硬壁菌门 （Firmicutes）。
图5细菌群落组成
在种水平上，主要由 Paraburkholderia_sartisoli （0.38%～3.80%）、Acetobacteraceae_bacterium_WX59 （0.38%～1.21%）和 Rhodospirillales_bacterium_URHD0088 （0.02%～1.01%）组成，占比为 1.67%～4.88%，其中 Paraburkholderia_sartisoli 随着土层深度的增加呈现先增后降的趋势，且枝条覆盖后的整体相对丰度较低，其中0～10 cm较地布覆盖减少0.25%、 10～20 cm 较地布覆盖减少 1.05%、20～30 cm 较地布覆盖减少 0.40%、30～40 cm 较地布覆盖增加 0.05%、40～50 cm 较地布覆盖减少 0.73%。 Acetobacteraceae_bacterium_WX59、Rhodospirillales_bacterium_URHD0088 呈现出随土层深度增加逐渐增加的趋势，且枝条覆盖后的相对丰度较低，但变化较小，均控制在 0.58% 变化范围内 （图5c）。前 3 菌种均属于变形菌门。
图6为真菌群落组成。在门水平上，主要由子囊菌门（Ascomycota，48.51%～71.69%）和担子菌门（Basidiomycota，9.75%～25.98%）、unclassified_Fungi（12.09%～24.84%）组成，前 3 物种占比 86.73%～95.81%。随着土层深度的增加，子囊菌门呈先增加后减少的趋势，担子菌门呈先减后增再减的波浪形趋势，unclassified_Fungi 呈先减后增的现象。其中，子囊菌门为同土层枝条覆盖小于地布覆盖（0～10 cm 较地布覆盖减少 8.46%、10～20 cm 较地布覆盖减少 13.53%、20～30 cm 较地布覆盖减少 13.25%、30～40 cm 较地布覆盖减少 12.32%、40～50 cm 较地布覆盖减少 2.46%），担子菌门为同土层枝条覆盖大于地布覆盖（0～10 cm 较地布覆盖增加 11.43%、10～20 cm 较地布覆盖增加 7.59%、20～30 cm 较地布覆盖增加 9.67%、30～40 cm 较地布覆盖增加 5.60%、40～50 cm 较地布覆盖增加 0.01%）。这说明枝条覆盖下有增加低水平物种丰度、降低高水平物种丰度的调节作用。unclassified_Fungi 在浅土层（0～30 cm）地布覆盖大于枝条覆盖，深土层（40～50 cm）则相反（图6a），但差距较小，控制在 3.00% 以内。这说明随着时间的增加，枝条对土壤的影响可能会逐渐加深。
图6真菌群落组成
在属水平上，主要由假散囊菌属（Pseudeurotium， 0.33%～44.29%）、unclassified_Fungi（12.09%～24.84%） 和 Gibellulopsis（0.60%～9.58%） 组成，前 3 物种占比为 22.33%～57.73%。假散囊菌属随着土层深度的逐渐增加呈现先增后减的现象，unclassified_Fungi 随着土层深度的逐渐增加呈现出先减后增的现象，Gibellulopsis 随着土层深度增加丰度逐渐降低。假散囊菌属在同土层枝条覆盖相对丰度明显低于地布覆盖（0～10 cm 较地布覆盖减少 5.46%、 10～20 cm 较地布覆盖减少 22.01%、20～30 cm 较地布覆盖减少 35.37%、30～40 cm 较地布覆盖减少 29.90%、40～50 cm 较地布覆盖减少 13.61%），说明假散囊菌属对枝条覆盖敏感，unclassified_Fungi 未表现出明显差距，差距在 4.08% 以内，Gibellulopsis 在枝条覆盖下相对丰度降低，且仅在 0～10 cm 土层有较大差异，相比地布覆盖降低 7.60%（图6b）。假散囊菌属、Gibellulopsis 属于子囊菌门，unclassified_Fungi 属于 unclassified_Fungi 门。
在种水平上，主要由 Pseudeurotium_sp、Fungi_sp、变黑轮枝菌（Gibellulopsis_nigrescens）组成，占比为 22.33%～57.73%，与属水平占比相同。说明，属水平的 3 个主要属下均只有相对应的 1 个种，故其不同土层枝条覆盖下 3 个物种的变化趋势与其各自的属相同，此处不在赘述（图6c）。其中 Pseudeurotium_sp、Gibellulopsis_nigrescens 属于子囊菌门，Fungi_sp 属于 unclassified_Fungi 门。
图7中，细菌在不同深度土层中，GC 的聚集性较 BC 强。其中 GCA 相对于 GC 其他深度聚集性较弱，有一定差异性，BC 各深度分散性较强，说明枝条覆盖后增强了细菌的多样性。真菌相较于细菌，其 GC 和 BC 都有一定分散性，且 GC 各深度聚集在一起，BC 各深度聚集在一起，没有交集 （细菌有一定交集），说明枝条覆盖后对真菌群落结构的影响强于细菌。
2.4 微生物群落差异物种
由图8可知，细菌群落在各土层中具有差异显著物种的处理分别为 GCA（5 种）、GCB（1 种）、 GCE（1 种）、BCE（1 种），其中属于地布覆盖的有 7 种，枝条覆盖的有 1 种，说明枝条覆盖有一定调节微生物均匀度作用。其中 GCA 有 5 种，说明 GCA 与其他各组的差异最大。其中，GCA 5 个差异物种中，Sphingomonadales、Sphingomonadaceae、 Sphingomonas 来自同一个目，unidentified_Acidobacteria、unidentified_Acidobacteria 来自同一个纲。且差异物种均属于酸杆菌门、变形菌门。
图7微生物群落结构
图8细菌群落组间差异
由图9可知，真菌群落各土层中具有差异显著物种的处理：BCA（15 种），BCB（6 种），BCC（4 种），GCA（9 种），GCB（2 种），GCC（3 种）， GCD（3 种），GCE（4 种）。其中，地布覆盖的每个土层深度均有差异物种，枝条覆盖 3 个土层深度有差异物种。在所有的差异物种中，子囊菌门占据 35 种，担子菌门占据 10 种，被孢梅霉门（Mortierellomycota）占 1 种。
2.5 微生物功能预测
图10a中，土壤中各处理的功能均主要由代谢、基因信息处理、环境信息处理组成，3 个功能占比为 80% 左右，且各处理功能差异不大。其中代谢以氨基酸代谢（6.17%）、碳水化合物代谢 （6.67%、能量代谢（3.03%）为主，基因信息处理主要包括翻译（5.39%）、复制与修复（4.95%），环境信息处理主要包括膜转运（6.39%）和信号转导（2.59%）（图10b）。
真菌功能主要由腐生生物（占比29.60%～61.36%）、未分类（ 占比 28.26%～48.45%） 组成，其中腐生生物随土层深度加深呈先增后减现象，且枝条覆盖后其功能（0～10 cm 土层增加 1.08%）的相对丰度有一定程度减弱，即 10～20 cm 较地布覆盖减少 7.34%、20～30 cm 较地布覆盖减少 11.44%、30～40 cm 较地布覆盖减少 19.96%、40～50 cm 较地布覆盖减少 3.19%，未分类随土层深度加深呈先减后增现象，且相对地布覆盖有一定程度增加（40～50 cm 降低 0.95%），即 0～10 cm 较地布覆盖增加 6.98%、 10～20 cm 较地布覆盖增加 9.34%、20～30 cm 较地布覆盖增加 2.67%、30～40 cm 较地布覆盖增加 18.65%（ 图11a）。由图11b可以得知，BCE 与 GC 处理的 5 个深度聚集在一起，且GCA～GCE 5 个处理聚集度强于 BCA～BCE 5 个处理聚集度。BCA、BCB、BCC、BCD 4 个深度聚在一起，从 BCA 到 BCD 距离 GC 聚集区域的距离越来越远，这说明枝条覆盖对土壤真菌微生物功能有一定影响，且随着深度的增加影响逐渐减弱。
图9真菌群落组间差异
图10细菌功能预测分析
2.6 土壤微生物相关性分析
对前 10 细菌门类与土壤理化性质及细菌功能进行相关性分析。如图12可知，前 10 菌门中，除 Firmicutes、Actinobacteria、Nitrospirae 外，均与细菌微生物部分功能有显著关系。其中 Proteobacteria、 Bacteroidetes 与相同细菌功能呈显著性关系，但相关性关系却相反，这说明此两种菌门可能存在拮抗作用。Acidobacteria 与 Chloroflexi 也存在类似关系。前 10 菌门中，Acidobacteria 与土壤有机质、有效磷、过氧化氢酶、脲酶呈显著性关系， Actinobacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes 与其中部分理化性质呈显著正相关关系。Nitrospirae 与测定的所有理化性质均呈显著性正相关关系。
图11真菌功能预测分析
图12细菌群落相关性分析
注：*、** 分别表示 0.05、0.01 水平显著相关。下同。
对前 10 真菌门类与土壤理化性质及真菌功能进行相关性分析。如图13可知，Ascomycota 和 unclassified Fungi 均与主要的真菌功能 Unassigned、 Saprotroph 呈显著性关系，且相关性关系相反。 Rozellomycota、Mortierellomycota、Aphelidiomycota、 Mucoromycota、Basidomycota 也与部分真菌功能呈显著性相关。前 3 菌门中仅有 unclassified Fungi 与有效磷有显著性负相关关系，其余的占比较小的 Glomeromycota、Mortierellomycota、Rozellomycota、 Blastocladiomycota 与土壤理化性质相关性较强。
图13真菌群落相关性分析
3 讨论
3.1 枝条覆盖对土壤理化性质影响
土壤养分对果树生长极为关键，有助于改善土壤性质[29]。其中，有机质、碱解氮、有效磷、速效钾常作为鉴定一个园区土壤是否肥沃的关键指标[30-32]。覆盖对提高土壤稳定性，改善土壤有良好效果[33]。本研究发现，枝条覆盖下，除碱解氮、有效磷在较深土层（20～50 cm）无明显提高外，有机质、碱解氮、有效磷、速效钾的含量在不同土层均有提高。究其原因可能为枝条覆盖会随着土层深度的加深对其的影响逐渐减弱，且随着枝条覆盖年限的增加，其对土层深度及影响程度会逐渐增加。土壤过氧化氢酶中，枝条覆盖仅对 0～10 cm 土层有积极影响，说明枝条覆盖仅提高了浅层土壤的过氧化氢分解能力，随着枝条覆盖年限的增加，可能会逐步增强土壤的过氧化氢酶活性。而在土壤脲酶中，枝条覆盖在各个深度整体均高于地布覆盖，说明枝条覆盖下，其土壤的尿素转化效率增加，能够促进土壤肥力的提高。基于此推测，经过 5 年的枝条覆盖，其土壤理化性质才稍有改变。这说明枝条覆盖对土壤理化性质的影响存在缓慢性，尤其在较深的土层，其养分提高更为缓慢，其缓慢性主要表现在随着时间的推移，才会逐步体现出覆盖的积极有效性。
3.2 枝条覆盖对土壤微生物多样性影响
土壤微生物在提高土壤肥力、促进植物生长等方面有重要作用[34-37]。与土壤理化性质的趋势类似，在微生物研究中，整体呈现枝条覆盖下微生物多样性有一定提高，这与 Hartmann 等[38]的研究一致，且表现出随土层深度不断加深，各指数不断下降的趋势。细菌中的 Chao1 指数和 Ace 指数在 0～10、30～40 cm 土层有明显升高，综合 Shannon 指数和 Simpson 指数未出现此种特点，分析原因可能为 Chao1 和 Ace 指数重在体现物种数量、丰富度，而 Shannon 和 Simpson 指数重点体现多样性，包含物种数量及均匀度，所以 Chao1 和 Ace 指数高是因为可能存在部分物种其数量极少，而 Shannon 和 Simpson 指数因注重均匀度的缘故，对于这种情况未计算其中，故而未出现突然升高的现象。除此之外，枝条覆盖下，真菌的微生物多样性变化幅度较细菌小，对 Shannon 指数、Simpson 指数的影响略高于 Chao1 指数和 Ace 指数。其原因可能为枝条覆盖对真菌多样性的影响弱于细菌，且对真菌物种种类数量的影响较小，但可能对其物种的丰度影响较大。从整体看，细菌、真菌的多样性在经过枝条覆盖后，在各深度大部分都有了一定提高，而且随着土层深度的加深，多样性指数的降低趋势也逐渐减缓，甚至在某些深度其多样性指数还有了突然升高的现象（Chao1 和 Ace 指数在细菌的 30～40 cm、真菌的 40～50 cm），说明枝条覆盖有利于物种多样性发展，且有使各土层深度多样性趋于一致的作用，有助于微生物不同深度均一性。
3.3 枝条覆盖对土壤微生物组成影响
研究发现，覆盖、间作等方式均会提高微生物多样性，且一般不会改变优势物种的种类，仅影响其丰度[39-41]。本研究也有类似发现，枝条覆盖后，土壤细菌微生物门水平仍主要由变形菌门和酸杆菌门组成，并未影响细菌微生物优势物种的更迭，但对相对丰度有一定影响，且对变形菌门有抑制作用，抑制作用随土层深度的增加呈现增加的趋势，这与前人研究覆盖大多能增加变形菌门结果不一致[42-43]。解析其原因可能为本结果的抑制作用均在 8.72% 以内，且本试验中的的变形菌门占比相对前人研究结果中的占比要多一些，因此，只是小范围的调整，这也从侧面证明了枝条覆盖对微生物的调节作用。对酸杆菌门有促进作用，其促进作用随土层深度先减后增。酸杆菌可分解难降解的碳源，对于分解植物残渣起重要作用[44]。粉碎枝条促进了酸杆菌的提高，酸杆菌也加速了枝条的分解。在属水平上，对相对丰度明显大于其他属的朱氏杆菌属有明显的抑制作用，对芽孢杆菌属的浅层土壤有促进作用，其余分布较均匀的属调节程度较小。这说明枝条覆盖的介入改善了细菌群落的微生物结构，且能根据物种丰度改善细菌微生物丰度，提高细菌微生物群落的均匀度，这与 Gao 等[45]的研究结果一致。芽孢杆菌属在促进激素调节、土壤健康、养分可用性和吸收等方面也存在积极作用[46]。枝条覆盖下芽孢杆菌的增加促进了土壤质量的提高。
真菌在枝条的介入下优势菌门也未改变，仍由子囊菌门和担子菌门组成，这与王小玲等[47]的研究一致。且这两个菌门是重要分解者，对分解植物残留物具有重要作用[48]。枝条覆盖下，随着土层的加深与地布覆盖子囊菌门的丰度差异逐渐变小，这既说明枝条覆盖的影响随土层深度增加而减弱，也与真菌功能中，随土层深度加深，与地布覆盖的差异性逐渐减小的结果一致。除此之外，对子囊菌门和担子菌门的抑制和促进作用相对细菌门类更加明显，其对相对丰度最大的子囊菌门抑制作用远大于对细菌中变形菌门的抑制作用，对相对丰度较低的担子菌门也有明显的促进作用，对相对丰度大的假散囊菌属、unclassified_Fungi、Gibellulopsis 属有明显的抑制作用。其中，Gibellulopsis 属下的唯一种 Gibellulopsis_nigrescens 是引起马铃薯、甜菜等作物土传病害的真菌之一[49-50]。枝条覆盖下 Gibellulopsis_nigrescens 的降低也间接证明了其有助于降低真菌病害的发生。有研究表明担子菌可以与植物形成菌根，加速根系对水分和养分的吸收[51]。枝条覆盖下担子菌门的增加对果树生长发育及果实的品质有积极影响。在对真菌属水平的进一步分析发现，在子囊菌门门下的假散囊菌属、 Gibellulopsis 属经枝条覆盖后的降低程度远大于子囊菌门的变化，说明在此门类中有部分物种经枝条覆盖后丰度提高，减小了门水平上的变化。这说明枝条对微生物的调节作用依物种不同而变化。而因梨树的腐烂病、黑星病、褐斑病、轮纹病、炭疽病等主要病害的病原菌属于子囊菌门，因此，虽然枝条覆盖导致了某些真菌丰度的增加，但可能由于降低了各土层的子囊菌门浓度，也就降低了梨树整体的病害发病率。枝条覆盖下真菌相对丰度的变化程度比细菌相对丰度变化情况更大，这也导致在微生物功能中，枝条覆盖下真菌功能的差异较细菌功能差异大。除此之外，本研究发现，枝条覆盖不同土层深度下的细菌、真菌的多样性、微生物组成的趋势偶尔在浅层 0～10 cm 时出现与其他深度不一致的现象，比如细菌的朱氏杆菌属在 0～10 cm 为枝条覆盖的相对丰度高，其余为枝条的相对丰度远低于地布覆盖。究其原因可能为浅层土壤除了受枝条覆盖的影响外，大气环境的温湿度等因素也会造成较大影响，而相对较深的土层因受大气环境中的影响较小，故而导致了这种差异。
在差异物种分析中，细菌的差异物种共有 8 种，其中地布覆盖占 7 种；真菌差异物种共有 46 种，其中地布覆盖占 21 种。这说明枝条覆盖对真菌的物种丰度影响较大，尤其细菌中差异物种大部分属于相对丰度大的变形菌门，真菌中的差异物种大部分属于相对丰度大的子囊菌门，这与前面对微生物多样性和物种组成分析的结果一致，因对真菌物种丰度的影响大于细菌，导致真菌的差异物种较多，因枝条覆盖对丰度大的菌门调节作用更显著，导致其差异物种均属于相对丰度大的门类。
在对细菌门类与细菌功能进行相关性分析后发现：相关性关系相反的两个门类变形菌门、拟杆菌门在细菌随土层深度变化的趋势也相反，且相对丰度大的菌门和细菌功能占比高的呈极显著关系。这说明可能由变形菌门、拟杆菌门两个菌门主导了细菌的主要功能。与此相似的还有真菌中的子囊菌门和 unclassified Fungi 菌门。除此之外，因酸杆菌门相对丰度高且与土壤理化性质相关性密切，推测细菌可能主要受有机质、有效磷影响，这与温宇珂等[52]、甄云楠等[53]的研究一致。
综上，梨园枝条覆盖对于土壤有一定的积极影响，但经过 5 年的枝条覆盖，其土壤理化性质的增长速度相对缓慢，粉碎枝条的自然分解也相对缓慢。但每年产生的废弃枝条较多。故目前的枝条覆盖只能处理部分废弃枝条的利用问题。因此，在明确长期枝条覆盖对土壤有益后，下一步需寻找途径来加速枝条的分解，加快枝条覆盖下土壤养分的提升，这也为下一步的研究提供了思路。
4 结论
梨园行内的长期枝条覆盖对于解决清耕和地布覆盖带来的土壤板结、养分流失及修剪产生的废弃枝条有一定意义。且经过 5 年的枝条覆盖，土壤的理化性质有所改善、酶活性也有了一定的提升。在调整微生物结构方面，通过针对不同物种，智能调节微生物群落丰度，平衡微生物群落结构，提高微生物的均匀度与稳定性，改善土壤微生态环境。本研究可为枝条覆盖的进一步应用提供理论参考。