摘要
为探究施肥模式对油菜根际氮转化功能菌群的影响，采用实时荧光定量 PCR 技术，系统评估了长期不同施肥处理［不施肥（CK）、单施无机肥（NPK）、单施有机肥（M）、有机与无机混施（MNPK）、仅施无机氮钾肥（NK）和仅施无机氮磷肥（NP）］下油菜根际与土体土中氮转化功能菌群丰度的差异。结果表明，不同施肥处理下，根际与土体土中氮转化功能菌群丰度的变化趋势总体一致。施用无机肥显著提高了氨氧化细菌、硝化杆菌（Nitrobacter）和 nirKC1 型反硝化菌的丰度；而 M 和 MNPK 处理，尤其是 MNPK 处理，显著增加了多种氮转化功能菌群的丰度，包括全程氨氧化菌（Comammox）分枝 A 和分枝 B、硝化螺菌（Nitrospira）、napA 型硝酸盐还原菌、nirSC1 型和 nirSC2 反硝化菌、nosZI型N2O 还原菌以及异化硝酸盐还原为铵菌等。不同施肥处理对地杆菌 （Geobacter）和土体土中固氮菌的丰度无显著影响。仅固氮菌、氨氧化古菌、Comammox 分枝 A 和分枝 B、nirKC1 型反硝化菌等 10 种功能菌群的丰度在特定施肥处理的根际与土体土间存在显著差异。冗余分析表明，施用有机肥是导致整体氮转化菌群群落变化的主导因素。相关性网络分析揭示，根际和土体土中多数氮转化菌群间存在显著相关性，构成了紧密连接的网络。随机森林分析显示，土壤理化性质，尤其是有效磷含量，是预测少数氮转化菌群丰度变化的主导因子，而其余大多数氮转化类群的变异主要由其他菌群的丰度变化所解释。综上所述，有机肥与无机肥混施可显著提高油菜根际氮转化功能菌群的丰度、增强氮素周转活性，从而更高效地为作物生长提供氮源，改善作物的氮素吸收和生产力。本研究结果为实际生产中推广有机肥与无机肥混施模式提供了理论依据。
Abstract
To investigate the effects of fertilization regimes on nitrogen-transforming functional guilds in the rapeseed rhizosphere，realtime fluorescence quantitative PCR was employed to systematically evaluate the differences in the abundances of nitrogen-transforming microbial guilds between rhizosphere and bulk soils under various long-term fertilization treatments：no fertilization control（CK）， inorganic fertilizer alone（NPK），organic fertilizer alone（M），combined organic-inorganic fertilization（MNPK），inorganic N-K fertilizer（NK），and inorganic N-P fertilizer（NP）．The results demonstrated that the shift trends in the abundances of nitrogen-transforming guilds in the rhizosphere and bulk soils were generally consistent across the fertilization treatments．Inorganic fertilization significantly increased the abundances of ammonia-oxidizing bacteria，Nitrobacter，and nirKC1-type denitrifiers．In contrast，the M and MNPK treatments，particularly the latter，markedly enhanced the abundance of diverse nitrogen-transforming guilds，including complete ammonia oxidizers（Comammox）clades A and B，Nitrospira，napA-type nitrate reducers， nirSC1- and nirSC2-type denitrifiers，nosZI-type N2O reducers，and dissimilatory nitrate reduction to ammonium bacteria． Fertilization regimes showed no significant effects on the abundance of Geobacter or nitrogen-fixing bacteria in bulk soil．Only ten functional groups（including nitrogen-fixers，ammonia-oxidizing archaea，Comammox clades A and B，and nirKC1-type denitrifiers） exhibited significant differences in abundance between the rhizosphere and bulk soils under specific fertilization treatments． Redundancy analysis revealed that application of organic fertilizer was the dominant factor driving community-level variations in nitrogen-transforming guilds．Correlation network analysis demonstrated significant interconnections among most nitrogen-transforming guilds in the rhizosphere and bulk soil，thereby forming tightly linked networks．Random forest analysis indicated that soil properties， particularly available phosphorus，served as primary predictors for abundance variations in some microbial groups，while changes in the abundances of other guilds predominantly explained variations in the majority of nitrogen-transforming groups．In conclusion， combination of organic and inorganic fertilizer significantly increased the abundance of nitrogen-transforming functional guilds in the rapeseed rhizosphere，improved nitrogen turnover activity，and consequently promoted an efficient nitrogen supply for crop growth while enhancing nitrogen uptake and productivity．These findings could provide a theoretical basis for promoting the combination of organic and inorganic fertilizersin agricultural production.
Keywords
微生物驱动的土壤氮循环是农田生态系统物质循环的重要组成部分，对系统净初级生产力具有决定性的影响[1]。其中，根际作为氮素微生物转化的关键“热点”区域，其氮素周转过程直接影响作物的氮素利用效率和产量[2]。因此，揭示根际氮转化规律及微生物机制，对于构建高效的氮肥管理策略、降低温室气体排放具有重要意义[3]。
氮素微生物转化过程复杂多样，包括氨化、固氮、硝化、反硝化、异化硝酸盐还原为铵（DNRA）、厌氧氨氧化（Anammox）、亚硝酸盐 / 硝酸盐依赖型甲烷厌氧化（n-DAMO） 和厌氧铁氨氧化 （Feammox）等一系列过程。这些过程通过中间产物相互联系，构成了复杂的氮循环网络[4]。大量研究表明，土壤氮转化过程及相关功能菌群对环境变化极为敏感[5]。作为农田生态系统最典型的人为干扰措施，施肥能够通过改变土壤及作物根际的生物和非生物学特性，塑造氮转化功能微生物群落，进而影响整个氮循环进程[4，6]。近年来，基于功能基因的定量分析技术为揭示微生物介导的氮转化过程提供了新的视角，其不仅能揭示微生物种群与实际转化过程之间的耦合关系，还可提供相关菌群的环境适应性特征，从而有助于加深对氮循环过程微生物机制的理解[7-9]。然而，现有研究多聚焦于特定氮转化过程的少数功能类群，对施肥模式如何系统性影响作物根际氮循环功能菌群的整体特征仍缺乏全面认知。
已有研究表明，不同施肥模式对氮转化功能菌群的影响存在差异[10-12]，施肥模式还会影响氮循环功能菌群在作物根际的定殖情况[13-14]。目前对于主要参与氮循环的功能菌群如氨氧化[13]、反硝化[14-15]、固氮[16] 和 Anammox 菌[17] 等对施肥和根际效应的响应模式已有较为充分的认识，并对驱动其变化的主导环境因素（如 pH 和有机质、氮、磷含量）进行了系统解析[15-18]。然而，关于功能微生物菌群间相互联系、如何影响其对施肥和根际效应的响应模式这一科学问题，目前仍缺乏相关研究。
油菜作为我国重要的油料作物，其产量形成高度依赖氮素的供应[19]。因此，研究施肥模式对油菜根际氮循环功能类群的影响，可为改善田间氮素管理策略、提高氮素利用效率提供理论指导。本研究通过采集长期不同施肥处理下油菜根际和土体土样品，运用荧光定量 PCR 技术系统分析了执行土壤固氮、氨氧化[氨氧化古菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB）和全程氨氧化菌（Comammmox）]、硝化[ 硝化螺菌（Nitrospira）和硝化杆菌 （Nitrobacter）]、硝酸盐异化还原（napA 和 narG 型硝酸还原菌）、反硝化（nirK 和 nirS 型反硝化菌）、N2O 还原（nosZI 和 nosZⅡ型N2O 还原菌）、 DNRA、n-DAMO（Candidatus Methanoperedens nitroreducens）、Anammox 和 Feammox[ 地杆菌 （Geobacter）]等过程功能菌群的丰度，以探究其对不同施肥处理的响应模式，并探究影响这些微生物种群变化的主导生物和非生物因子。
1 材料与方法
1.1 试验地概况及样品采集
供试大田试验于 1989 年建立，位于浙江省嘉兴市海宁市许村镇农业农村部土壤质量嘉兴野外科学观测研究站内（30°26′04″N，120°25′01″E）。实验站海拔4 m，年平均温度 16～17℃，年降水量 1500～1600 mm，土壤类型为潴育型水稻土，种植制度为水稻-油菜轮作。试验小区采用埋深 100 cm 的水泥埂分隔，以确保各小区的独立性。试验开始前，0～20 cm 耕层土壤基本理化性质：有机质（OM）28.7 g·kg-1、全氮（TN）1.67 g·kg-1、全磷（TP）2.53 g·kg-1、全钾（TK）22.1 g·kg-1、碱解氮（AN）94.1 mg·kg-1、有效磷 （AP）37.4 mg·kg-1、速效钾（AK）67.5 mg·kg-1、 pH 6.4。样品采集涉及 6 个处理，分别为不施肥对照（CK）、单施无机肥（NPK）、单施有机肥 （M）、有机与无机肥混施（MNPK）、单施无机氮和磷肥（NP）以及单施无机氮和钾肥（NK）。其中，CK 不施用任何肥料；M 和 MNPK 处理每年施 22500 kg·hm-2 新鲜厩肥，均匀分配于水稻和油菜两季；NPK 和 MNPK 处理无机肥全年施用量为 N 375 kg·hm-2、P2O5 187.5 kg·hm-2、K2O 187.5 kg·hm-2；NP 和 NK 处理除不施无机钾肥或磷肥外，其余无机肥施用量与 NPK 处理相同。所有施用无机肥的处理中，稻季氮肥施用量为 N 240 kg·hm-2，油菜季为 N 135 kg·hm-2，N∶P2O5 ∶K2O施肥量按 2∶1∶1 比例施入。
2023 年，于油菜盛花期采集根际土壤和土体土壤。根际土的采集采用“抖根法”。具体操作如下：采用“S”形取样法在每个小区内随机挖掘 10 株油菜植株，小心剥离与植物根系松散结合的土壤后，剧烈抖动植株，使用无菌毛刷收集与植物根系紧密结合的残留土壤，置于无菌自封袋内混匀，于-20℃ 保存。同时，在取样位点附近植株行间使用土钻采集土体土，取样深度为 0～20 cm。采集的土壤过 2 mm 筛去除石块和植物残体后，于-20℃保存。
1.2 土壤理化性质测定
主要土壤基本理化性质的测定参考鲍士旦[20] 的方法。简述如下：新鲜土样烘干至恒重后，采用称重法测定土壤含水量（WC）；风干土样按水土比 2.5∶1 混合，振荡 30 min 后，使用 pH 计测定土壤悬浊液的 pH；土壤 TN 采用元素分析仪测定；土壤 OM 采用外加热重铬酸钾容量法测定；土壤 TP 采用酸溶-钼锑抗比色法测定；硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）参考 Yin 等[21]的方法测定；AP 以 0.5 mol·L-1 的 NaHCO3 浸提，浸提液采用钼锑抗比色法测定；土壤 AN 采用碱解扩散法测定；土壤 TK 采用 NaOH 熔融-火焰光度法测定；土壤速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定。
1.3 土壤 DNA 提取和实时荧光定量 PCR
土壤 DNA 采用 Fast DNA SPIN Kit for Soil 试剂盒和 JXFSTPRP-CLN-24 研磨仪（上海净信实业发展公司）提取，具体提取步骤参考说明书进行。提取产物的质量和浓度分别通过采用 1% 琼脂糖电泳和 Nanodrop（美国赛默飞世尔科技公司）进行检测。
尽管多项研究显示，与 Candidatus Methylomirabilis oxyfera 相关的类群是执行 n-DAMO 过程的主要微生物[22]，但本研究使用常用引物对 cmo182/cmo568[23] 进行扩增时，未能获得特异性产物（表1），因此未对该类群进行进一步分析。其余引物的选择依据前人对引物覆盖范围和特异性的评估[24-31]，具体引物序列及针对的氮循环功能类群见表1。标准曲线通过含有目的基因的单克隆质粒制备，质粒浓度采用 Picogreen dsDNA Quantitation Reagent[翌圣生物科技 （上海）公司]测定；使用 Easy dilution[宝生物工程 （大连）公司]对质粒进行梯度稀释，制备浓度范围为 101 ～108 拷贝·μL-1 的标准曲线。定量 PCR 在 Roche480 系统（瑞士罗氏公司）上进行。除 nosZII 的扩增采用 Biorad iTaq Universal SYBER Green Supermx（美国伯乐生命医学产品公司）且引物添加量为 1.0 μmol·L-1 外，其余功能基因均使用 NovoStart® SYBR qPCR· SuperMix Plus（苏州近岸蛋白质科技公司），引物浓度为 0.2 μmol·L-1。扩增程序设置：94℃预变性 3 min， 45 个扩增循环（94℃变性 15 s，特定退火温度 30 s， 72℃延伸 30 s，80℃信号采集 10 s），扩增结束后获取溶解曲线。所有基因扩增的标准曲线决定系数均大于 0.99，各功能基因的退火温度见表1。
表1本研究使用的氮循环功能类群引物信息
注：AOA、AOB、Comammox、Nitrobacter、Nitrospira、DNRA、Geobacter 分别为氨氧化古菌、氨氧化细菌、全程氨氧化菌、硝化杆菌、硝化螺菌、异化硝酸盐还原为铵、地杆菌。下同。
1.4 数据分析
统计分析和绘图在 R 4.0.2 中进行[37]。采用单因素方差分析结合 Tukey HSD 两两比较法评估不同处理间土壤理化性质和氮循环功能类群丰度的差异，同时结合双因素方差分析评估取样部位和施肥效应对土壤理化性质的影响。通过 t 检验评估处理内根际与土体土之间功能类群丰度的差异。采用冗余分析（RDA） 探究氮循环功能微生物群落变异与环境因子之间的关系，分析前物种数据和环境因子数据进行标准化处理。使用 Mantel 检验评估氮循环功能菌群群落结构与环境因子之间的相关性。采用 1000 次置换的置换多元方差检验（PERMANOVA）评估施肥和取样部位对整体氮循环功能菌群群落结构的影响。RDA、Mantel 检验和 PERMANOVA 均使用 vegan 包[38]。此外，采用斯皮尔曼相关系数网络探究土壤理化性质与氮循环功能菌群丰度之间的相关性，相关网络图采用 Gephi 0.9.2 绘制。最后，使用随机森林模型评估土壤理化性质和不同氮循环功能微生物种群丰度对预测指定功能微生物种群丰度变异的重要性（使用 randomForest 包）[39]。
2 结果与分析
2.1 不同施肥处理对土壤基本理化性质的影响
由表2可见，除根际 NH4+-N 和 TK 含量外，施肥模式对其他基本理化指标均产生显著影响。在土体土和根际中，与其他处理相比，MNPK 和 M 处理，尤其是前者，不仅显著提高了 TN、TP、OM、 AN、AP 和 NO3--N 含量，同时还提高了土体含水量。与其他施肥处理相比，NK 处理导致土体土和根际 TP 和 AP 含量显著下降；其中，相较于 CK， NK 处理使土体土 TP 和 AP 含量分别下降 14.1% 和 41.7%。与 CK 相比，仅 NPK 和 NP 处理显著改变了土体土 pH，分别降低 10.4% 和 9.7%；NP 处理同时减少了土体土 TK 含量以及土体土和根际 AK 含量。仅 M 处理显著增加了 NH4+ 含量。
表2长期不同施肥对油菜非根际和根际土壤基本理化性质的影响
注：WC、TN、TP、TK、OM、AN、AP、AK、NH4+-N、NO3--N 分别表示土壤含水量、全氮、全磷、全钾、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、铵态氮、硝态氮。下表、图同。同行数据后不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
双因素方差分析表明（表3），施肥是影响大多数基本理化指标的主要因素，而取样部位对 WC、TP、 OM、AN、AK 和 NH4+-N 含量具有显著影响。总体而言，与土体土相比，根际土壤 WC 和 TP 含量相对较低，但 AK、AN、OM 和 NH4+-N 含量较高。同时，土壤 pH 和 OM、AN、AP、AK、NO3--N 含量受施肥与取样部位交互效应的显著影响。如，M 和 MNPK 处理根际土壤 pH 下降，而 NP 处理根际土壤 pH 升高。
表3土壤理化性质双因素方差分析结果
2.2 长期不同施肥对土体土和根际氮循环功能微生物种群丰度的影响
图1显示，处理间根际氮循环功能类群丰度的变化趋势与土体土基本一致。除地杆菌、根际固氮菌，以及土体土中的 narG 型硝酸盐还原菌和 n-DAMO 菌外，施肥对其余氮循环功能菌群丰度均有显著影响。具体而言，相较于 CK 和单施无机肥（NPK、NK 和 NP），施用有机肥（M 或 MNPK） 显著增加了根际和土体中 Comammox 分枝 A 和分枝 B、硝化螺菌、napA 型硝酸盐还原菌、nirSC1 型和 nirSC2 反硝化菌、nosZI型N2O还原菌以及 DNRA 菌的丰度。与 CK 和 M 处理相比，施用无机肥（NPK、MNPK、NK 或 NP）处理则显著提高了 AOB、硝化杆菌和 nirKC1 型反硝化菌的丰度，显著降低了 nirSC2 型反硝化菌的丰度。与 CK 处理相比，所有施肥处理均显著增加了土体土 AOA 的丰度，但只有 NK 与 M 处理间存在显著差异；不均衡施肥（NK 和 NP）则导致根际 AOA 丰度显著下降。 Anammox 丰度仅在 MNPK 处理的土体土和根际显著高于其他处理；nosZⅡ型 N2O还原菌的丰度在 MNPK 处理下最高，但在土体土中仅显著高于 NK 处理，在根际则仅显著高于 NP 处理。
对同一处理内土体土与根际的比较分析显示，尽管部分功能类群（如 AOA、AOB 和 Comammox 分枝 A）在多个处理的根际相较于土体土表现出一致增加或降低的趋势，但仅有固氮菌、AOA、 Comammox 分枝 A 和分枝 B、nirKC1 型反硝化菌等 10 种功能菌群在特定施肥处理内存在显著差异。其中，固氮菌和 AOA 丰度在这些处理的根际显著下降，而 Comammox 分枝 A、nirKC1 型反硝化菌和 napA 型硝酸还原菌等丰度则在根际显著增加。值得注意的是，在根际与土体土之间丰度差异显著的氮转化功能菌群多集中于 NK 处理，表明不施磷肥对根际土壤氮循环功能菌群具有更显著的影响。
图1不同施肥处理下油菜根际和土体土各氮转化功能菌群的丰度
注：Anammox、n-DAMO 分别表示厌氧氨氧化、亚硝酸盐 / 硝酸盐依赖型甲烷厌氧化。柱上不同大写或小写字母表示相同取样部位的不同处理间差异显著（P<0.05）。
2.3 氮循环功能微生物群落结构与环境因子的冗余分析
RDA 分析结果显示（图2A），所测理化性质能够解释整体氮循环功能菌群丰度变异的 68.58%。其中，第一冗余轴（RDA1）解释了 51.22% 变异，将有机肥处理（M 和 MNPK）与其他处理显著区分开来；OM、TN、NO3--N、AN、AP、TP 和 WC 在该轴上具有较高的载荷。这表明施用有机肥引起的上述环境因子变化，尤其是 OM 和 TN 的显著增加，是驱动整体功能菌群群落变异的主要因素。第二冗余轴（RDA2）解释了 20.58% 的变异，土壤 TK、 pH、AK 和 NH4+-N 含量在该轴上载荷极高；CK 和 NK 处理沿该轴聚为一簇，与 NPK 和 NP 处理形成的簇明显分离。在所有处理中，仅 M、NK 和 NP 处理中观测到土体土与根际间整体氮转化菌群的显著差异。PERMANOVA 分析进一步表明，施肥是影响群落变化的主导因素（R2 =0.68，P<0.001），而取样部位的解释比例仅为 6.1%（P<0.001）。Mantel 检验结果显示（ 图2B），除 NH4+-N、AK 和 TK 外，其余测定环境因子均与群落变化呈显著正相关 （P<0.05）；同时，除 AK 和 TK 外，各理化因子之间普遍存在高度相关性。
2.4 相关性网络
功能微生物类群与环境因子的相关性网络分析显示（图3A 和 B），土体土和根际网络中涵盖了所测定的绝大多数氮循环功能类群，揭示功能微生物之间存在广泛的紧密联系。网络模块能够反映模块内微生物相似的生态位偏好或生态学关联[40]。在土体土和根际的网络中，最大模块均包含 nirSC1、DNRA 和 Comammox 分枝 A 等功能类群，以及 TP、AP、OM、TN 和 AN 等因子。这显示上述微生物可能是这两类生境中的关键功能类群，且具有相似的生境偏好或共同受这些环境因子的调控。土体土网络的最大模块还包括 napA 型硝酸还原菌、Comammox 分枝 B 和 nosZⅡ型 N2O 还原菌，而根际网络则包括 AOA 和硝化螺菌。节点度（即节点间相互连接的边数）可反映节点在网络中的重要性，高连接度的节点通常视为网络的关键节点[40]。通过节点度分析发现，在土体土网络中，具有高连接度的氮循环功能菌群依次为 napA 型硝酸盐还原菌、 nirSC1 型反硝化菌、DNRA 和 nosZⅡ型 N2O 还原菌； 而在根际网络中，则为 nosZI型N2O 还原菌、narG 型硝酸盐还原菌、硝化螺菌和 DNRA 菌。这表明不同生境中关键的氮转换功能菌群存在显著差异。
图2整体氮循环功能菌群与理化性质的冗余分析（A）以及 Mantel 相关矩阵图（B）
注：NH4+、NO3- 代表铵态氮、硝态氮。
图3氮循环功能菌群丰度与环境因子斯皮尔曼相关性网络。
注：A，土体土；B，根际。网络中的不同模块用不同颜色表示。Nitrogen foxer、Ammonium、Nitrate、Mooisture 分别表示固氮菌、铵态氮、硝态氮、含水量。下同。
2.5 因子重要性分析
随机森林模型评估结果表明（图4A 和 B），在土体土中，土壤理化性质是预测 Anammox、 Comammox 分枝 A、narG 型硝酸盐还原菌、nirSC1 型反硝化菌、固氮菌以及 nosZⅡ型 N2O 还原菌菌群丰度变化的最重要因子。其中，土壤 AP 含量对 Comammox 分枝 A、硝化螺菌和 Anammox 等 8 个功能类群的丰度变异具有较高的预测能力。其余功能微生物类群的丰度变异主要受其他类群丰度的影响；尤其值得注意的是，在所有功能类群中，napA 型硝酸还原菌对 10 种功能类群丰度变化的预测作用显著。类似地，在根际中，土壤理化性质是预测 Anammox、Comammox 分枝 A 和 nirSC1 型反硝化菌菌群丰度变化的最重要因子。然而，与土体土不同，根际的 DNRA、nirSC2 型反硝化菌和硝化螺菌的丰度变异也主要由理化性质解释；其中，AP、 TN、AN 和 TP 是预测多种功能类群丰度变化的关键变量。其余 13 种功能类群的丰度则主要受其他类群丰度的调控；特别是，DNRA 菌对 Comammox 分枝 A、硝化螺菌、nosZI型N2O还原菌和 nirSC1 型反硝化菌等 11 种功能类群丰度变化表现出较强的预测能力。
图4预测各氮转化功能类群变异的因子相对重要性。
注：A，土体土；B，根际土。*、** 分别表示显著性水平 P<0.05、P<0.01。
3 讨论
3.1 施肥模式和根际效应对氮循环功能微生物种群的影响
本研究结果表明，供试土壤中氮循环功能菌群的丰度主要受有机肥施用的影响。具体而言，无机肥处理特异性地促进了 AOB、硝化杆菌和 nirKC1 型反硝化菌等少数类群的增殖，而有机肥（尤其是 MNPK 处理）则对氮循环功能菌群具有更广泛的促进作用，显著提高了大多数功能菌群的丰度。已有研究表明，不同施肥模式对氮转化功能菌群的影响存在显著差异[7，10，15，18，41]。无机肥虽然养分释放迅速，但效果短暂；相比之下，有机肥则能持续稳定地提供丰富的养分和资源，改善土壤物理结构，增加微生物多样性，并促进整体微生物种群增长[15，18，41]。此外，无机肥处理中富集的 AOB、硝化杆菌和 nirKC1 型反硝化菌通常属于 r-策略型微生物[42-43]；这些类群生长迅速，偏好富营养环境，并对环境变化敏感，能快速响应外源养分输入[43-44]。而有机肥处理中增加的类群，如AOA、Comammox、硝化螺菌和 DNRA 菌等，通常生长缓慢，偏好缓慢释放的氮源，属于 K-策略型微生物[45-46]。因此，施肥模式对菌群的影响是肥料养分供给动态特性与菌群生存策略协同作用的结果。结合氮转化菌群丰度与功能过程的关联性[7-9]，MNPK 处理较高的菌群丰度表明其具有更为活跃的氮素周转能力，从而能够更高效地为作物生长提供氮源。因此，在田间管理实践中，采用有机肥与无机肥混施模式有助于提高作物的氮素吸收效率和生产力。
植物根际的微生物群落通常与周围土体土存在明显差异，这一现象被称为根际效应[3]。研究表明，根际效应能稳定富集多种氮转化类群（如反硝化菌、氨氧化菌、DNRA 菌、固氮菌和 Anammox 等）于小麦、玉米、水稻等植物的根际[13，47-50]。然而，本研究发现，油菜根际功能菌群的丰度主要受施肥模式影响。尽管部分类群（如 AOA、AOB、 Comammox 和 DAMO）在根际表现出一致的升高或降低趋势，但仅在特定处理下，少数功能类群（如 Comammox、nirKC1 型和 nirSC1 型反硝化菌） 表现出显著的根际效应，这与前人研究结果有所不同[13-14，48-49]。这种差异可能与植物氮肥利用策略有关。例如，Thion 等[51]发现，资源探索性植物的根际显著富集 AOA，而 AOB 更易受土壤 pH 影响； Moreau 等[52]对 11 种植物的研究表明，高氮吸收效率的植物根际中硝酸盐异化还原菌丰度较低。此外，作物生育期内对氮素需求的波动也会影响根际氮转化菌群的招募[53-55]。例如，Li 等[54]发现，水稻根际对 Anammox 菌的富集效应在分蘖期最强；Hai 等[55]研究表明，热带农田生态系统中，固氮菌、反硝化菌和氨氧化菌的丰度在高粱根际随生育期发生显著变化。因此，在比较不同研究中氮转化功能菌群对根际效应的响应模式时，需综合考虑作物类型和生育期差异。综上所述，本研究表明，施肥模式是油菜盛花期根际氮循环功能菌群变化的主导因素。
3.2 影响氮循环功能类群生物和非生物因子的相对重要性
关于施肥驱动氮循环功能菌群群落演替的环境因子，已有大量研究进行了深入探讨[7-8，13，15]。现有文献普遍认为，长期施肥导致的土壤酸化是氨氧化、反硝化、N2O 还原、DNRA、固氮等多种氮循环菌群丰度下降的关键因素[7-8，16，41]。尽管本研究发现，长期施用无机肥显著降低了土壤 pH，并对土体土和油菜根际中 AOB、Comammox 分枝 A 和硝化杆菌等类群产生显著影响，但多维度分析表明，土壤 OM、AN 和 AP 含量才是导致驱动氮转化功能菌群丰度变化的主要环境因子。与 pH 下降约 10% 相比，施用有机肥使土壤 OM 和 AN 大幅提升约 60%，这不仅为 Comammox、napA 型硝酸盐还原菌、nirS 型反硝化菌等不同代谢营养型的氮转化菌群提供了丰富多元的底物，还通过改善土壤水分保持能力和物理结构，形成了异质化微生境，为这些菌群的生存和发展创造了更多生态位[15，41，56]。此外，磷素有效性已被证实是影响土壤多种氮转化功能类群群落的重要因子[57]。这既源于磷作为微生物生长必需元素的作用，也与磷素缺乏时土壤微生物为满足代谢化学计量比例平衡而对碳、氮元素的转化受限有关[58-59]。本研究进一步发现，长期不施磷肥在油菜根际显著富集了全程氨氧化菌、反硝化菌和 N2O 还原菌等菌群，这些菌群积极参与农田氮素损失过程，提示磷素匮乏可能加速油菜根际氮素损耗，降低氮肥利用效率。因此，均衡施肥对提升作物氮素利用效率具有重要意义。
通过对整体氮循环功能菌群的分析，本研究发现，相较于环境因子，菌群间的相互联系对更多类群丰度变化的影响更为显著。在土体土和油菜根际中，绝大多数氮转化类群间存在显著相关性，构成了致密的相关性网络。这一结果与 Kuypers 等[4] 的观点一致，他们认为土壤氮素循环本质上是由紧密联系的微生物转化过程组成的复杂网络，并提出从网络视角探究生态系统氮循环的微生物机制。这种类群间联系并非偶然。首先，许多功能类群既能执行相同转化过程，同一类群亦可参与不同过程[60]，例如，nirS 和 nirK 型反硝化菌及 DNRA 菌均具有编码异化硝酸盐还原酶的 napA 基因，可共同执行硝酸盐异化还原[8]，部分 DNRA 菌还具备 N2O 还原能力[4，8，60]。其次，不同功能类群间常呈协作、偶联或竞争关系[4，42]。例如， AOB 与硝化杆菌协作加速氨氧化中间产物 NO2- 向 NO3- 转化，并进一步与反硝化菌关联，加剧土壤氮素损失[42，61]；而 DAMO 菌则与反硝化菌竞争底物[62]。尽管本研究揭示的许多类群间联系的生态学意义尚待阐明，但这些发现为后续研究以及氮肥管理策略设计提供了重要参考。例如，DNRA 菌在土体土和油菜根际与固氮菌、Comammox 分枝 A 和分枝 B 及 nosZI型N2O 还原菌呈现显著正相关性，且对其丰度变化具有较好的预测作用。通过进一步明确这些相关性的生态机制，可通过合理施肥（如增施有机肥、减施无机肥）提升 DNRA 菌群丰度，同时促进固氮菌、Comammox 及 nosZI型N2O还原菌的生长，从而减少氮素损失并降低 N2O 释放。
4 结论
施用有机肥显著提高了土壤 OM、AN 和 AP 含量，成为驱动土体土及油菜根际整体氮转化功能菌群丰度变化的主要环境因子。有机肥与无机肥混施对多数功能类群表现出显著的促进作用，表明该处理下土壤氮素周转更为活跃，能够更高效地为油菜生长提供氮源。长期不施磷肥则会增加油菜根际参与氮素损失过程的功能类群丰度，可能导致氮素利用效率降低。此外，氮转化功能类群间的相互联系对多数类群丰度变化的影响更为显著，表明供试土壤中氮转化过程之间存在紧密关联。
