摘要
杧果（Mangifera indica Linn.）作为一种热带、亚热带重要经济作物，其生长态势和最终产量受多因素综合影响，而土壤微生物在其中扮演者不可或缺的调节角色，成为推动作物生长的关键生物因子。为深入剖析杧果树滴水线内土壤真菌和细菌菌落结构特征，采集杧果树滴水线内不同深度土壤样品，结合 Illumina 测序和生物信息学分析其结构特征。结果显示，（1）土壤真菌菌落结构特征：在土壤垂直深度上，0 ～ 20 cm 土样的真菌菌落最为丰富，而 20 ～ 40 cm 土样的真菌菌落多样性相对较低，且分布不均匀；3 个样本土壤真菌总数为 1883 种，其中 0 ～ 20 cm 土样中真菌种类较为丰富；3 个样本的真菌共归属于 13 个门，优势菌门有子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）等；包含 453 属，优势菌属有被孢霉属（Mortierella）、裸节菌属（Talaromyces）、木霉属（Trichodermas）等；3 个样本中存在 67 个能诠释组间差异的物种；3 个样本均检测到 892 种酶，相对丰度较高的代谢通路包括有氧呼吸 I（细胞色素 c）、有氧呼吸Ⅱ （细胞色素 c）、棕榈酸酯生物合成 I。（2）土壤细菌菌落结构特征：与真菌菌落多样性特征相似，0 ～ 20 cm 土样同样呈现出最高的细菌菌落丰富度；土壤细菌种类达 10903 种，且细菌总数和特有细菌数量在不同样本中的分布均呈现出 0～20 cm>40～60 cm>20～40 cm 的规律；3 个样本的细菌共归属为 41 个门，优势菌门有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和厚壁菌门（Firmicutes）等；归属为 907 个属，优势菌属有芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）和假单胞菌属（Pseudomonas）等；3 个样本中存在 95 个能诠释组间差异物种；共检测到 4359 种蛋白质，归纳为 23 个大类，涵盖了氨基酸转运与代谢、能源产生与转换、细胞外结构等多种重要的生理功能类别；3 个样本均检测出 2326 种酶，包括 DNA 导向的 DNA 聚合酶、泛醌还原酶［H（+）－转运］DNA 解旋酶、组氨酸激酶、Peptidylprolyl 异构酶等多种对细菌生命活动至关重要的酶类；存在 439 种代谢通路，相对丰度值介于 0.03 ～ 127225.30 之间，其中相对丰度较高的通路包括有氧呼吸 I（细胞色素 c）、丙酮酸发酵制异丁醇（工程）、L- 异亮氨酸生物合成Ⅱ。综上，杧果树滴水线内表层土壤真菌和细菌种类较为丰富，不同土壤样本中各类功能的细菌相对丰度存在明显差异及特定变化规律。此外，不同样本中特定代谢通路相对丰度也各不相同，为深入理解杧果树滴水线内土壤真菌和细菌的代谢特征提供了重要依据。
Abstract
Mangifera indica Linn.，a highly significant economic crop thriving in tropical and subtropical zones，is subject to the impact of numerous factors．Soil microorganisms play an indispensable role in regulating the growth of Mangifera indica Linn．Soil samples from different depths were collected and analyzed by Illumina sequencing and bioinformatics to explore the structure of fungal and bacterial colonies in the soil of mango trees along the drip line．The results showed that， （1）The structural characteristics of soil fungal colonies：The diversity of fungal colonies was the most abundant in the soil depth of 0-20 cm，while the diversity of fungal colonies was relatively low and the distribution was uneven in the soil depth of 20-40 cm．There were 1883 species of soil fungi in the three samples，with the most abundant species in the 0-20 cm soil sample．The fungi from the three samples belonged to 13 phyla，and the dominant phyla were Ascomycota，Basidiomycota and Mortierellomycota，and so on．The three samples contained 453 genera，including Mortierella，Talaromyces， Trichodermas，and so on．Sixty-seven species from the three samples could explain the differences among the groups．892 kinds of enzymes were obtained from the three samples，and the pathways with higher relative abundance were aerobic respiration I（cytochrome c），aerobic respiration Ⅱ（cytochrome c），and palmitate biosynthesis I．（2）The structure of bacterial colonies：Similar to the diversity of fungal colonies，soil samples of 0-20 cm had the highest bacterial colony richness．A total of 10903 species of soil bacteria were identified in the drip line of mango trees．The distribution of total and unique bacteria in different samples showed the order of 0-20 cm>40-60 cm>20-40 cm．A total of 41 phyla was identified in the three samples，including Proteobacteria，Acidobacteriota，and Firmicutes．All the bacteria in the three samples were classified into 907 genera，including Bacillus，Flavobacterium and Pseudomonas，and so on．These 95 species from the three samples could explain the differences among the groups．A total of 4359 proteins were detected，which were grouped into 23 categories，covering a variety of important physiological function categories such as amino acid transport and metabolism，energy production and conversion，and extracellular structure．These 2326 enzymes were detected in all three samples，including DNA-directed DNA polymerase，ubiquinone reductase［H（+）-transporting］DNA helicase， Histidine kinase，Peptidylprolyl isomerase，and other enzymes that were essential for bacterial life activities．There were 439 kinds of pathways，and their abundance values ranged from 0.03 to 127225.30．The highest relative abundance were aerobic respiration I（cytochrome c），isobutanol production by pyruvate fermentation（engineering），L-isoleucine biosynthesis Ⅱ． In conclusion，there were abundant fungi and bacteria in the surface soil of mango trees in the drip line．There were significant differences in the relative abundance of bacteria with different functions and specific changing patterns in different samples．In addition，the relative abundance of specific metabolic pathways varied among samples，which provided important information for understanding the metabolic characteristics of soil fungi and bacteria in the drip line of mango tree.
Keywords
杧果（Mangifera indica Linn.） 属于漆树科 （Anacardiaceae）杧果属（Mangifera），是一种热带、亚热带重要经济作物，享有“热带果王”的美誉；也是一种常绿乔木果树，具有抗旱耐瘠、固持沙土、美化环境等特征[1-3]。目前，中国杧果生产主要位于海南、四川、广西、云南、贵州等地区的南亚热带区域，其种植面积达 34.34 万 hm2 ，产量达 331.2 万 t，居世界第二位[4-5]。贵州省的杧果种植主要在贵州南、北盘江及红水河流域（俗称“两江一河”）低海拔河谷区进行，已成为该地区发展现代山地生态高效农业的重要内容之一[6]。
土壤微生物是调节作物生长的重要驱动者。健康土壤微生物群落不仅可以增强作物自身抵抗力、改善树木生长状况，还能稳定土壤碳库、维持生境质量[7]。在果园土壤微生物研究中，主要利用平板培养、脂肪酸甲酯图谱法、宏基因组学等技术手段进行微生物群落结构和功能的解析，为果园生态系统的可持续经营和管理提供理论支持和实践指导。研究发现，根际细菌和真菌在防治苹果树根腐病方面表现巨大潜力[8]；有益微生物可以改善土壤结构，增加土壤有机质含量，促进养分循环，从而增强果树对氮、磷、钾等主要营养元素的吸收能力[9]。此外，土壤微生物通过分解有机物质，促进碳素循环，有助于土壤碳库的形成和稳定。同时，某些微生物能够参与温室气体如二氧化碳、甲烷等的固定或转化，从而减缓全球气候变化。但是，果园土壤微生物的多样性和活性受到多种因素的影响，包括土壤理化性质、果园管理以及果树生长状况等。朱正钰[10]研究表明土壤理化性质对微生物群落的结构和活性有显著影响。刘霏霏等[11]证实，在苹果园种植苜蓿绿肥，能显著改善土壤微生物群落组成，提高土壤细菌丰富度、拷贝数和多样性，显著提高土壤微生物功能。因此，注重微生物群落与果树健康、土壤环境、气候变化之间的复杂相互作用，利用分子生物学和大数据技术来精确解析和调控这些相互作用尤为重要。通过试验与实践，能够在果园管理中实现微生物资源的精准应用，促进果园生态系统的整体健康和可持续发展。
高通量测序技术，亦称为下一代测序技术，能够在短时间内对大量 DNA 分子进行并行测序，显著提高了测序的速度和通量[12]。通过 Illumina 平台的 HiSeq 或 MiSeq 系统，研究者可以获取数以亿计的短序列读数，经组装和分析后，能够揭示土壤样本中真菌和细菌的种类、丰度以及它们之间的相互作用[13]。使用高通量测序技术分析了不同农业管理实践下的土壤微生物群落，结果表明，土壤管理方式对微生物群落结构和功能具有显著影响[14]。本研究通过比较杧果树滴水线内不同土层土壤样本的测序数据，利用 Alpha 多样性指数和 Beta 多样性指数来评估土壤微生物群落的内部多样性和样本间的差异性，再进行功能预测，旨在为杧果生产可持续发展和土壤健康管理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验地基本概况
试验地位于贵州省望谟县平洞街道办贵州省亚热带作物研究所望谟示范园内，25°11′6.69″N， 106 °04 ′46.36 ″E。该试验点属于亚热带季风气候，全年无霜、年均气温 19.5℃、年均日照时数 2174.2 h、年均降水量 1236.8 mm、海拔 548.3 m。果园土壤质地为砂壤土，pH 值为 5.5、有机质 19.56 g/kg、全氮 1.15 g/kg、有效磷 18 mg/kg、速效钾 768 mg/kg。果园种植的杧果品种为金煌杧，树龄 7 年，株行距 3 m×4 m，果园自然生长的饭包草覆盖了其他杂草的生长。
1.2 样品采集
土壤样品于采果后（2024 年 8 月 4 日） 在贵州省亚热带作物研究所望谟示范园内进行收集，在杧果树滴水线内分别取距土壤表层 0～20、 20～40 和 40～60 cm 处土壤，每棵树采取梅花点法取样，即五点取样混合后为 1 个重复，取 5 棵树为 1 组。每个重复通过四分法混合，最后预留 0.5～1.0 kg 装入干净结实的自封袋中，贴上标签，带回实验室存于 4℃冰箱中备用。样品信息见表1。
表1样品采集基本信息表
1.3 测序
土壤微生物基因组 DNA 提取采用 ZR Soil Microbe DNA MiniPrepTM Kit（Zymo Research）进行，并通过超微量核酸定量仪进行质量和浓度检测。选择引物 ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和 ITS2-R （5′-GCTGCGTTCTTCATCGATG-3′）引物扩增真菌 ITS，使用引物 338-F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806-R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对 16SrRNA 基因 V3～V4 可变区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。PCR 体系：5×TransStart FastPfu 缓冲液 4μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，上游引物（5 μmol/L）0.8μL，下游引物（5 μmol/L）0.8μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶 0.4μL，模板 DNA 10 ng，补足至 20μL。PCR 反应程序：95℃预变性 3 min，23 个循环（95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s），然后 72℃稳定延伸 10 min，最后在 4℃进行保存（PCR 仪：ABI GeneAmp 9700 型）。使用 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit （BiooScientific，Austin，Texas，USA）对纯化后的 PCR 产物进行建库。利用 Illumina 公司的 PE250 平台进行测序。根据重叠关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行操作分类单元（OTU）聚类分析和物种分类学分析。
1.4 生物信息学分析
Illumina 测序得到 PE reads 进行质控和过滤，再拼接，获得质控拼接后的优化数据。结合 OTU 聚类分析结果，进行 Alpha 多样性指数分析，其中 Chao、Ace、Sobs 指数反映菌落丰富度，Shannon、 Simpson 指数反映菌落多样性，Coverage 指数反映菌落覆盖度；以及对测序深度进行检测；最后，在各个分类水平上进行群落结构的统计。采用 R 语言 4.4.1 的 vegan 包绘制菌落热图。基于 Bray-Curtis 距离法绘制主坐标分析（PCoA）图；利用 Galaxy 软件的线性判别分析及影响因子（LEfSe）组件分析组间物种差异特征，及其对组间差异的影响程度[15]；采用基于标记基因序列预测功能丰度软件 （PICRUSt2）进行功能丰度预测，其中 16S 数据提供蛋白质直系同聚簇（COG）、基因与基因组数据库（KEGG）、代谢路径数据库（MetaCyc）的功能预测结果，ITS 数据提供 KEGG 和 MetaCyc 的功能预测结果[16]。
2 结果与分析
2.1 杧果树滴水线内土壤真菌菌落结构特征分析
2.1.1 Alpha 多样性分析
根据高通量测序结果，按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于 97% 就可以认为属于不同的种，相似性为 93%～95% 可以认为属于不同的属。杧果树滴水线内不同深度土样共鉴定出 1897 个真菌 OTUs，分类归属于 13 门 42 纲 102 目 245 科 453 属 626 种；其中子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门 （Basidiomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）相对丰度较高，分别是 56.65%、24.18% 和 8.66%。
通过 Kruskal-Wallis H 检验方法对真菌 Alpha 多样性分析，其中 Ace、Chao 和 Sobs 指数是估算物种总数的指数，Shannon 和 Simpson 指数是估算微生物多样性的指数。结果表明（图1），不同土层的真菌菌落丰富度 Ace、Chao 和 Sobs 指数随土层深度先降低后增加的趋势，且不同土层间均存在显著性差异（P<0.05）。在所有土样中，t1（0～20 cm 土样）土样的真菌菌落丰富度最高，其 Ace 指数为 550.3。从 Shannon 和 Simpson 指数的分析结果来看，不同土层的菌落多样性同样存在显著差异，其中 t2（20～40 cm）土样的真菌菌落多样性较低，且分布不均匀。此外，Coverage 指数反映菌落覆盖度，3 个样本的 Coverage 指数值均接近 1，表明样本中序列被测出的概率较高，而未被测出的概率较低。
2.1.2 组成分析
韦恩图反映多个样本中所共有和特有的物种。通过 R 语言工具统计，杧果树滴水线内土壤真菌共有 1883 种，其中样品 t1（0～20 cm 土样）中真菌总数为 1307 种、样品 t2（20～40 cm 土样）中真菌总数为 681 种、样品 t3（40～60 cm 土样）中真菌总数为 894 种；不同深度土壤中均有特有的真菌，其中 0～20 cm 土样中特有真菌有 701 种、 20～40 cm 土样中特有真菌有 154 种、40～60 cm 土样中特有真菌有 311 种，3 个土层样本共有真菌有 282 种。由此可见，无论是真菌总数还是特有真菌数量，样品 t1 均高于 t2 和 t3，表明杧果树滴水线内表层土壤中真菌种类较丰富（图2A）。
图1不同土层真菌 Alpha 多样性指数柱状图
注：横坐标为样本名，纵坐标为观测到的所选分类水平下的某一指数类型的数值。
从门的分类层面上分析显示（图2B），3 个样本共涵盖 13 个门，其中占据主导地位的是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）等。在 3 个样本中，子囊菌门的占比均为最高，从土壤表层到深层，其所占比例依次为 59.13%、50.11% 和 55.24%；其次是被孢菌门，在表层至深层土壤中的占比分别是 26.35%、32.16% 和 19.39%。
从属的层面上分析显示（ 图2C），3 个样本中总计包含 453 个属，主要的属有被孢霉属 （Mortierella）、裸节菌属（Talaromyces）、木霉属 （Trichodermas）等。同一属在不同样本间的占比存在差异，不同属在同一样本中的占比同样各不相同。以被孢霉属为例，在 0～20 cm 土样中占比为 18.26%、在 20～40 cm 土样中占比达 32.07%、在 40～60 cm 土样中占比则是 12.83%；裸节菌属在 0～20 cm 土样中占 8.84%、在 20～40 cm 土样中占 1.31%、在 40～60 cm 土样中占 21.62%；木霉属在 0～20 cm 土样中占 0.29%、在 20～40 cm 土样中占 17.47%、在 40～60 cm 土样中占 3.12%。具体来说，在 0～20 cm 土样中被孢霉属占比最高，达 18.26%；20～40 cm 土样中也是被孢霉属占比最高，为 32.07%；而在 40～60 cm 土样中，占比最高的则是裸节菌属，占比 21.62%。
图2不同土层真菌群落组成分析
2.1.3 Beta 多样性分析
试验基于 Bray-Curtis 距离算法，对杧果树滴水线内不同土层的土壤真菌群落组成结构相似性或差异性进行主坐标分析（PCoA）。结果表明 （图3），PCoA1 轴和 PCoA2 轴分别解释 19.97% 和 17.02% 的组间差异，合计解释为 36.99% 的组间差异，显示土壤真菌组成受不同土层的影响。利用 ANOSIM 组间差异分析发现，土壤真菌菌落组间差异大于组内差异（R=0.394666666666666），且差异显著（P=0.003）。
图3不同土层真菌群落组成结构相似性或差异性分析
注：Between 指不同土层样品组之间的差异。图8 同。
2.1.4 LEfSe 多级物种差异多样性分析
LEfSe 用于多样本中最能解释组间差异的物种特征，以及这些特征对组间差异的影响程度，揭示了组间富集真菌类群的差异。分析结果（图4） 显示，在 3 个样本中，共计 67 个物种能诠释组间差异，其中 t1 中有 56 个，t2 中有 2 个，t3 中有 9 个。在 t1 样本中，被孢霉科 Linnemannia 属、丝孢酵母科 Apiotrichum 属和裸子囊科 Leucothecium 属的线性判别分析得分（LDA）值分别为 4.51、 4.50、4.42，而毛壳菌科 Corynascella 属为 2.73； t2 样本中仅存在肉座菌科木霉属和曲霉科青霉属 （Penicillium），其 LDA 值分别为 4.95 和 4.75； 在 t3 样本中，LDA 值排前 3 的是被孢霉科（4.25）、毛壳菌科 Stellatospora 属（3.64）、刺球壳科 Chloridium 属（3.51），LDA 值最小的是球囊霉科，为 3.04（图4）。说明 t2 样本中肉座菌科木霉属和曲霉科青霉属对组间差异的影响最为显著，其次是 t1 样本中被孢霉科 Linnemannia 属、丝孢酵母科 Apiotrichum 属和裸子囊科 Leucothecium 属。
2.1.5 功能预测
基于 ITS 基因序列，运用 PICRUSt2 软件对土壤真菌基因家族的功能进行丰度预测。
KEGG 分析结果显示，3 个样本均识别出 892 种酶，其中相对丰度较高的 3 种酶分别是三磷酸腺苷酶（酶编号：3.6.1.3）、葡聚糖-1，4-葡糖苷酶（ 酶编号：3.2.1.3） 和 DNA 指导的 RNA 聚合酶（酶编号：2.7.7.6），且 3 种酶在 3 个样本中相对丰度均位列前 3 名。三磷酸腺苷酶在 t1 中的相对丰度为 2809208.40，在 t2 中为 2826510.50，在 t3 中为 2868097.30；葡聚糖-1，4-葡糖苷酶在 t1 中的相对丰度为 1945899.65，在 t2 中为 2257388.64，在 t3 中为 2131300.19；DNA 指导的 RNA 聚合酶在 t1 中的相对丰度值为 1881209.82，在 t2 中为 1897982.06，在 t3 中为 1931655.05。
MetaCyc 通路结果（图5）显示，相对丰度较高的通路包括有氧呼吸 I（细胞色素 c）（通路编号：PWY-3781）、有氧呼吸Ⅱ（细胞色素 c）（通路编号：PWY-7279）、棕榈酸酯生物合成 I（通路编号：PWY-5994）。其中，有氧呼吸 I（细胞色素 c）在 t1 中的相对丰度为 240887.14，在 t2 中为 243901.47，在 t3 中为 249105.30；有氧呼吸Ⅱ（细胞色素 c）在 t1、t2、t3 中的相对丰度与有氧呼吸 I（细胞色素 c）一致；棕榈酸酯生物合成 I 在 t1 中的相对丰度为 138227.89，在 t2 中为 165743.95，在 t3 中为 126871.70。
图4不同土层间真菌 LEfSe 进化分支图
2.2 杧果树滴水线内土壤细菌菌落结构特征分析
2.2.1 Alpha 多样性分析
3 个样本中共鉴定出 10994 个细菌 OTUs，被归入 41 门 127 纲 289 目 471 科 907 属 1915 种。
同样采用 Kruskal-Wallis H 检验方法对 3 个样本细菌 Alpha 多样性分析（图6），结果显示，不同土层的细菌菌落丰富度，也就是 Ace、Chao 和 Sobs 指数随土层深度呈先降低后增加的趋势。只有 Sobs 指数在不同土层间表现出显著差异（P<0.05），这一现象表明，由于计算算法不同，不同土层间差异情况有所不同。在所有土层中，0～20 cm 土样的细菌菌落丰富度最高，Ace 指数为 2865.0。从 Shannon 和 Simpson 指数来看，不同土层的菌落多样性存在显著差异。其中，20～40 cm 土样的细菌菌落多样性较低，且分布不均匀，这与之前对真菌菌落多样性研究结果相似。3 个样本的 Coverage 指数值均接近 1，表明样本中序列未被测出的概率较低，保证了此次研究数据的可靠性。
2.2.2 组成分析
经 R 语言工具统计分析（ 图7A），杧果树滴水线内土壤细菌总计 10903 种。其中，样品 t1 （0～20 cm 土样）含细菌 6776 种、样品 t2（20～40 cm 土样）含细菌 4369 种、样品 t3（40～60 cm 土样）含细菌 5274 种。不同土层中均有特有的细菌，0～20 cm 土样中有 3787 种、20～40 cm 土样中有 1478 种、40～60 cm 土样中有 2121 种，3 个样本共有的细菌为 1999 种。从细菌总数和特有细菌数量来看，均呈现 t1>t3>t2 的关系，表明果园表层土壤的细菌种类更为丰富。
图5不同样本中 MetaCyc 通路的相对丰度
从样本与物种关系图（ 图7B） 来看，3 个样本总共归属于 41 门，主要包括变形菌门 （Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和厚壁菌门（Firmicutes）等。在 3 个样本中，变形菌门的占比均为最高，从表层到深层，其比例依次为 38.67%、48.88% 和 39.15%；其次是酸杆菌门，从表层到深层，其比例依次为 9.54%、17.21% 和 18.90%；厚壁菌门的比例从表层到深层则分别是 12.69%、6.95% 和 12.54%。
图6不同土层细菌 Alpha 多样性指数柱状图
注：横坐标为样本名，纵坐标为观测到的所选分类水平下的某一指数类型的数值。
从群体柱形图来看（图7C），3 个样本的细菌共归属为 907 属。其中，3 个样本中未被明确坚定到具体属级分类单元的细菌群体占比高，在 t1 样本中为 53.77%、t2 样本中为 30.75%、t3 样本中为 38.47%。此外，在 t1 样本中，占比前 3 的分别是芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium） 和假单胞菌属（Pseudomonas），占比依次为 6.68%、 5.23%、5.15%；在 t2 样本中占比前 3 的分别是丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria，属未分类）、热酸菌属（Acidothermus）和黄杆菌属（Flavobacterium），其值为 14.83%、5.51%、5.13%；在 t3 样本中所占比例前 3 的分别是酸杆菌纲（Acidobacteriae，属未分类）、酸杆菌纲（Acidobacteriae，属未分类）和伯克氏菌属（Burkholderia），占比依次分别为 4.88%、 4.20%、3.31%。
2.2.3 Beta 多样性分析
同样采用 Bray-Curtis 距离算法，对杧果园不同土层的土壤细菌群落组成结构相似性或差异性进行主坐标分析（PCoA）。结果表明（图8），主坐标成分 PCoA1 轴和 PCoA2 轴分别解释了 35.17% 和 13.42% 的组间差异，两者合计解释了 48.59% 的组间差异，表明土壤细菌组成显著受到不同土层的影响。进一步利用 ANOSIM 组间差异分析发现，土壤细菌菌落组间差异与 t2 组内差异相当，大于 t1 和 t3 组内差异（R=0.345777777777777），且差异显著 （P=0.017）。
图7不同土层细菌群落组成分析
2.2.4 LEfSe 多级物种差异多样性分析
如图9所示，3 个样本共识别出 95 个物种对组间差异具有诠释作用，其中 t1 中有 47 个，t2 中有 40 个，t3 中有 8 个。t1 中能诠释组间差异细菌的 LDA 值在 3.51～3.89 之间，其中鞘脂单胞菌科、芽单胞菌科、红细菌科的 LDA 值较为突出，分别达到 3.86、3.80、3.76。t2 样本中，对组间差异解释能力较强的细菌中伯克氏菌科、Acidothermaceae 科嗜酸栖热菌属、Rhodanobacteraceae 科朱氏杆菌属的 LDA 值位列前 3，分别为 4.42、4.42、4.31，而 LDA 值最小的是微杆菌科，为 2.69。t3 样本中仅检测到厚壁菌门和酸杆菌门，且未分类到属， LDA 值在 3.65～4.82 之间，但由于其分类不明确，难以进行更深入的分析。综上所述，t2 样本中能诠释组间差异细菌具有较大的 LDA 值，对差异效果影响最为显著。
图8不同土层细菌群落组成结构相似性或差异性分析
图9不同土层间细菌 LEfSe 进化分支图
2.2.5 功能预测
基于 16S rRNA 序列，采用 PICRUSt2 软件进行土壤细菌基因家族功能丰度预测，通过 COG 分析发现，共检测到 4359 种蛋白质，归纳为 23 个大类，涵盖氨基酸转运与代谢、能源产生与转换、细胞外结构等类别（图10）。在相对丰度方面，氨基酸转运与代谢在 t1、t2 和 t3 样本中的值分别是 8300483.50、8142989.30、7871281.55，呈现出逐渐降低的趋势；能源产生与转换在 t1、t2 和 t3 样本中的相对丰度值分别是 5658924.06、5881557.74、 5525624.85，核糖体机构和生物起源在 t1、t2 和 t3 样本中的相对丰度值依次是 5732445.37、 5764929.00、5535828.56，两者的相对丰度变化趋势均为先升高后降低；而细胞外结构在整个土壤细菌中的相对丰度最低，在 t1、t2 和 t3 样本中的相对丰度值分别为 209.32、205.75、334.65。这些数据表明，不同土壤样本（t1、t2 和 t3）中各类功能的细菌相对丰度存在明显差异及特定变化规律。
图10不同样本 COG 功能分类统计柱形图
KEGG 分析结果（图11）表明：3 个样本均检测出 2326 种酶。酶的种类丰富，包括 DNA 导向的 DNA 聚合酶（酶编号：2.7.7.7）、泛醌还原酶[H（+）-转运 ]（酶编号：1.6.5.3）、DNA 解旋酶（ 酶编号：3.6.4.12）、组氨酸激酶（酶编号：2.7.13.3）、 Peptidylprolyl 异构酶（ 酶编号：5.2.1.8）、细胞色素 c 氧化酶（ 酶编号：1.9.3.1） 等。上述 6 种酶在 3 个样本中的相对丰度均处于较高水平，如 DNA 导向的 DNA 聚合酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 374505.76、380460.34、362947.54，泛醌还原酶[H（+）-转运 ] 在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 360995.19、376401.16、 362493.34，DNA 解旋酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 343366.69、337473.72、326056.53，组氨酸激酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 303810.31、318282.81、297537.64，Peptidylprolyl 异构酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 220681.93、 237821.10、211901.11，Peptidylprolyl 异构酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度分别为 198399.91、 204374.35、197460.94，细胞色素 c 氧化酶在 t1、 t2 和 t3 中的相对丰度分别为 170839.69、199969.16、 184870.54。整体来说，杧果树滴水线内土壤细菌中，酶的相对丰度最大值为 380460.34，最小值为 0.01；大多数酶在 t1、t2 和 t3 中的相对丰度呈现先升高后降低的趋势，而少数酶的相对丰度则逐渐降低。
图11不同样本 KEGG 分析热图
MetaCyc 通路分析结果（图12）表明，在杧果树滴水线内土壤细菌中，共鉴定出 439 种代谢通路。这些通路的相对丰度值跨度较大，在 0.03～127225.30 之间。其中，有氧呼吸 I（细胞色素 c）（通路：PWY-3781）、丙酮酸发酵制异丁醇 （工程）（通路：PWY-7111）、L-异亮氨酸生物合成Ⅱ（通路：PWY-5101）等通路的相对丰度较高； 如有氧呼吸 I（细胞色素 c）在 t1、t2、t3 中的相对丰度分别为 120773.97、127225.30、119691.42，丙酮酸发酵制异丁醇（工程）在 t1、t2、t3 中的相对丰度分别为 69322.16、69708.13、67885.47，L-异亮氨酸生物合成Ⅱ在 t1、t2、t3 中的相对丰度分别为 65212.04、65762.91、63425.28。揭示了不同样本中特定代谢通路相对丰度的差异，为深入理解杧果树滴水线内土壤细菌的代谢特征提供了重要依据。
图12不同样本中 MetaCyc 通路的相对丰度
3 讨论
近年来，高通量测序技术凭借其高效、精准、大规模检测的优势，在土壤微生物检测领域得到了极为广泛的应用。王守兴等[17]借助高通量测序技术分析了不同草地类型土壤微生物多样性特征。余垚颖等[18]通过高通量测序技术探究了施用调理剂对土壤微生物群落结构的影响。本研究聚焦于杧果树滴水线内土壤，针对真菌开展 Alpha 多样性分析，结果表明，0～20 cm 土样的真菌菌落丰富度最高，Ace 指数为 550.3；而 20～40 cm 土样的真菌菌落多样性较低，且分布不均匀。经统计，3 个样本土壤真菌共计 1883 种，其中 0～20 cm 土样中真菌总数和特有真菌数量均高于 20～40 cm 土样和 40～60 cm 土样，这充分显示出杧果树滴水线内表层土壤的真菌种类更为丰富。Hu 等[19]研究中国西南热带喀斯特地区 5 种土地利用类型（果园、蔗田、人工林、草地和次生林）下土壤微生物丰度和多样性，发现酸杆菌门和子囊菌门在次生林中丰度最低，在蔗田中丰度最高。从门的分类层面剖析分析，本研究的 3 个样本涵盖 13 个门，优势菌门包括子囊菌门、担子菌门和被孢菌门等。其中，子囊菌门在 3 个样本中的占比均为最高，从表层到深层依次为 59.13%、50.11% 和 55.24%，这与刘晴等[20]研究红松林地不同土层真菌菌落多样性的优势菌门研究结果相符。被孢霉属真菌是一类土生的腐生真菌，在富含有机质的土壤中大量存在，是土壤碳及养分转化的关键微生物成员[21]；木霉属真菌则能够抑制土壤传播植物病原菌和部分地上病害[22]。从属的分类层面来看，3 个样本含有 453 属，优势菌属有被孢霉属、裸节菌属、木霉属等，推测杧果树滴水线内土壤富含有机质，且部分真菌能抑制病原菌生长。不同样本中同一属的比例存在差异，同一样本中不同属的比例也各不相同。通过 PCoA 和 ANOSIM 分析，认为 5 种土地利用方式下土壤细菌和真菌群落结构存在显著差异[19]。就杧果树滴水线内不同土层的土壤真菌群落组成结构而言，主坐标成分共计解释为 36.99% 的组间差异。在 3 个样本中，有 67 个物种能诠释这种组间差异，其中 t1 中有 56 个，t2 中有 2 个，t3 中有 9 个。土壤酶在土壤微生物营养和能量获取、污染物降解、有机质分解等生态过程中发挥着重要作用[23]。本研究的 3 个样本均检测到 892 种酶，其中相对丰度较高的有三磷酸腺苷酶、葡聚糖-1，4-葡糖苷酶和 DNA 指导的 RNA 聚合酶。相对丰度较高的通路有有氧呼吸 I（细胞色素 c）、有氧呼吸 II（细胞色素 c）、棕榈酸酯生物合成 I。
在土壤细菌方面，已有研究表明不同土层细菌菌落结构存在差异，土壤深度越深，细菌群落结构差异越小[24]。常博然等[25]研究表明，土壤细菌的 4 种 Alpha 多样性指数在 0～20 cm 土层普遍高于 20～40 cm 土层。本研究对细菌 Alpha 多样性分析，结果显示，0～20 cm 土样的细菌菌落丰富度最高，Ace 指数为 2865.0；20～40 cm 土样的细菌菌落多样性低且分布不均匀。杧果树滴水线内土壤细菌总计 10903 种，细菌总数和特有细菌数量呈现 t1>t3>t2 的规律，证实了表层土壤的细菌种类更为丰富。郭翠莲等[26]发现尖叶木樨榄天然林地不同土层土壤优势细菌群有变形菌门、芽单胞菌门、放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门。本研究的 3 个样本共归属于 41 个门，优势菌门有变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门等。其中，变形菌门在 3 个样本中的占比均为最高，从表层到深层分别为 38.67%、48.88% 和 39.15%。芽孢杆菌属可改善土壤理化性质、提高土壤肥力、抑制有害微生物。黄杆菌属能够将复杂的有机物质分解成简单的无机物质，有助于土壤中有机质的矿化，促进氮、磷等元素的利用；假单胞菌属具有改善土壤结构、提高肥料利用率、增强作物抗逆性等功能[27-28]。本研究从群体柱形图来看，3 个样本的细菌归属为 907 属，优势菌属包括芽孢杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等，说明滴水线内土壤优势菌属对杧果园土壤理化性质改善、有机质提升均有促进作用。主坐标成分共计解释为 48.59% 的组间差异。3 个样本中有 95 个物种能诠释组间差异，其中 t1 中有 47 个， t2 中有 40 个，t3 中有 8 个。经 COG 分析，共检测到 4359 个蛋白质，归纳为 23 个大类，涵盖氨基酸转运与代谢、能源产生与转换、细胞外结构等。 KEGG 结果显示，3 个样本均含有 2326 种酶，包括 DNA 导向的 DNA 聚合酶、泛醌还原酶[H（+）-转运]DNA 解旋酶、组氨酸激酶、Peptidylprolyl 异构酶等。MetaCyc 通路分析表明，杧果树滴水线内土壤细菌中存在 439 种通路，其相对丰度在 0.03～127225.30 之间。其中，有氧呼吸 I（细胞色素 c）、丙酮酸发酵制异丁醇（工程）、L-异亮氨酸生物合成Ⅱ的相对丰度较高。尽管本研究已对杧果滴水线内土壤微生物的菌落结构展开分析，但该区域微生物与杧果品质、产量之间的相互影响及作用机制，仍有待进一步深入探究。
4 结论
杧果滴水线内土壤真菌菌落结构特征为在 0～20 cm 土样展现出最高的真菌菌落丰富度，而 20～40 cm 土样的真菌菌落多样性较低，且分布不均匀。经统计，3 个样本土壤真菌共计 1883 种，其中 0～20 cm 土样所含的真菌种类相对更为丰富。从分类学的门水平来看，3 个样本涵盖了 13 个菌门，优势菌门有子囊菌门、担子菌门和被孢菌门等。在属水平上，3 个样本含有 453 属，优势菌属有被孢霉属、裸节菌属、木霉属等。3 个样本中有 67 个物种能诠释组间差异。在土壤酶和代谢通路方面，3 个样本均检测到 892 种酶，相对丰度值较高的通路包括有氧呼吸 I（细胞色素 c）、有氧呼吸 Ⅱ（细胞色素 c）、棕榈酸酯生物合成 I。
杧果滴水线内土壤细菌菌落结构特征，在细菌菌落丰富度方面，0～20 cm 土样表现出最高水平，这一特征与真菌菌落多样性相似，呈现出表层土壤微生物丰富度较高的一致性规律。杧果树滴水线内土壤细菌多达 10903 种，且细菌总数和特有细菌数量在不同样本中的分布呈现出 t1>t3>t2 的显著规律。在门水平上，3 个样本共归属于 41 个门，优势菌门有变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门等。在属水平上，3 个样本的细菌共归属为 907 属，优势菌属包括芽孢杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等。3 个样本之间存在 95 个能诠释组间差异的物种。在对土壤细菌的蛋白质、酶以及代谢通路的研究中，共检测到 4359 个蛋白质，归纳为 23 个大类，涵盖了氨基酸转运与代谢、能源产生与转换、细胞外结构等多个重要的生理功能类别；3 个样本均检测出 2326 种酶，包括 DNA 导向的 DNA 聚合酶、泛醌还原酶[H（+）-转运]DNA 解旋酶、组氨酸激酶、Peptidylprolyl 异构酶等多种关键酶；存在 439 种通路，其相对丰度在 0.03～127225.30 之间，其中相对丰度较高的有有氧呼吸 I（细胞色素 c）、丙酮酸发酵制异丁醇（工程）、L-异亮氨酸生物合成Ⅱ。
综上，杧果树滴水线内表层土壤真菌和细菌种类较为丰富，不同土壤样本中各类功能的细菌相对丰度存在明显差异及特定变化规律。此外，不同样本中特定代谢通路相对丰度也各不相同，为深入理解杧果树滴水线内土壤真菌和细菌的代谢特征提供了重要依据。
