摘要
以温室大棚为主的设施农业长期种植易导致土壤板结、土壤酸化、土壤盐渍化等，进而导致土壤细菌群落失衡，严重制约设施蔬菜的可持续发展。利用高通量测序技术等研究了不同种植年限对设施菜地土壤细菌群落以及土壤化学性质的影响，并探究土壤化学因子与细菌群落变化的关联性。研究结果表明，随着种植年限的增加，土壤 pH 由 5.85 下降至 5.11、全氮由 1.29 g/kg 增加至 1.68 g/kg、碱解氮由 120.22 mg/kg 增加至 222.40 mg/kg（P<0.05）、总盐度由 1.97% 增加至 2.85% ～ 3.27%。经过长达 20 年种植，细菌α多样性显著降低（P<0.05），经置换多元方差分析分析表明细菌群落结构发生显著变化（P<0.01）。在前 10 门、属中，变形菌门的相对丰度降至最低 （20.69%），而厚壁菌门和绿弯菌门的相对丰度则分别增加了 3.21%、22.14%，达到 4.40%、30.40%；鞘氨醇单胞菌属和芽单孢菌属相对丰度分别下降 3.66%、1.94%（P<0.05）。典型相关性分析表明 pH、碱解氮是影响细菌群落结构的主要环境因子（P=0.011、P=0.036）。种植时间延长（>10 年）导致土壤酸化及氮素积累，显著降低细菌群落多样性，改变细菌群落结构，进而引发土壤微生态失衡，制约设施蔬菜地的可持续利用。
Abstract
Long-term cultivation in greenhouse facilities could lead to soil compaction，soil acidification，and soil salinization，which in turn caused imbalances in soil bacterial communities and severely restricted the sustainable development of facility vegetables．The high-throughput sequencing technology and other methods were utilized to investigate the effects of different planting years on soil bacterial communities and soil chemical properties in facility vegetable fields， and to explore the correlations between soil chemical factors and bacterial community changes．The results showed that as the planting years increased，soil pH decreased from 5.85 to 5.11，total nitrogen increased from 1.29 g/kg to 1.68 g/kg， available nitrogen increased from 120.22 mg/kg to 222.40 mg/kg（P<0.05），and total salinity increased from 1.97% to 2.85%-3.27%．After 20 years of planting，bacterial α-diversity significantly decreased（P<0.05），and PERMANOVA analysis indicated significant changes in bacterial community structure（P<0.01）．Among the top 10 phyla and genera，the content of Proteobacteria decreased to the lowest level of 20.69%，while the contents of Firmicutes and Chloroflexi increased by 3.21% and 22.14%，respectively，reaching 4.40% and 30.40%．The relative abundances of Sphingomonas and Bacillus decreased by 3.66% and 1.94%，respectively（P<0.05）．Canonical correlation analysis indicated that pH and available nitrogen were the main environmental factors affecting bacterial community structure（P=0.011，P=0.036）．With the extension of planting time（>10 years），soil acidification and nitrogen accumulation occurred，significantly reducing the diversity of bacterial communities，altering the structure of bacterial communities，and subsequently causing an imbalance in soil microecology，which could restrict the sustainable utilization of facility vegetable land.
设施蔬菜生产在满足人们生活需求和增加农民收入方面发挥着重要作用。目前，我国设施蔬菜栽培面积已经超过 400 万 hm2[1]。然而，设施蔬菜地长期过量的施用化肥，养分循环高度集中化，极易导致土壤盐渍化、酸化、微生物多样性降低等一系列问题[2-3]。其中，微生物对于维持土壤质量和保持土壤健康具有重要作用[4-6]。因此，弄清楚设施蔬菜地长期种植过程中微生物的变化，对合理评估设施农业土壤健康、维持设施农业可持续利用具有重要意义[4-6]。
土壤细菌是土壤中最丰富和最多样化的微生物群，每克土壤中含有数亿种细菌，这些细菌对土壤养分含量和肥力的变化表现出高度敏感性，并能够快速响应环境变化[7]。此外，某些细菌种类在逆境条件下能够保护植物免受病原体侵害，从而增强植物的抗逆性[8-9]。然而，由于大棚蔬菜地的管理方式和施肥方法的特殊性，其土壤的理化性质和细菌群落结构与其他农业用地存在显著差异。孙殷沁沁等[10]研究发现，宁夏地区的设施栽培显著提升了土壤细菌的α多样性，年降水量、年平均温度及土壤电导率等环境因素对大田土壤细菌群落结构产生了显著影响；Liu 等[11]指出设施种植通常具有高养分投入、高灌溉频率和较高土壤温度等特点，这些因素会导致土壤微生物群落发生显著变化。然而，当前关于种植年限对设施蔬菜地土壤细菌多样性与群落组成的影响尚不明确。
尽管已有大量研究关注设施蔬菜地长期种植土壤环境因子与细菌群落，但其影响因素存在较大差异。土壤有机质与全氮是影响设施细菌群落结构的主要环境因子[12]；有机质是影响不同类型土壤细菌群落差异的主要驱动因素[13]；速效钾是影响设施细菌群落结构的主要环境因子[3]；pH 和速效钾是影响设施细菌群落结构的主要环境因子[14]。因此，进一步探究细菌群落与土壤理化性质之间的关系仍具有重要意义。
本研究以安徽省江淮区域典型设施农业不同种植年限的设施蔬菜地为对象，采集土壤样品并分析其细菌群落特征和土壤理化性质，旨在研究不同种植年限对设施蔬菜地土壤微生物群落结构的影响，揭示细菌群落的变化规律及其环境驱动因子，为设施蔬菜地土壤的合理利用和科学改良提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验设置于在安徽省滁州市全椒县大墅镇（北纬 32.02°，东经 117.96°），海拔 58.5 m。该区域属于亚热带季风气候，年平均气温 15.4℃，平均年降水量 1000～1100 mm，全年降水分布不均，主要集中于 7—9 月份。土壤为黏壤土，母质以河流冲积物为主，保水能力、透气性适中，比较适宜农作物种植生长。
1.2 试验设计
在该区域选取了 2 种不同种植年限（10 年， Y10；20 年，Y20）的大棚蔬菜地进行研究，并以露天蔬菜地作为对照（CK）。每个处理设置 3 个重复样本。研究区域主要种植作物包括大豆、辣椒和甘蔗。在施肥管理上，氮磷钾复合肥为基肥，施用量为 1600～2400 kg/hm²；尿素为追肥，施用量为 521～782 kg/hm²，年均养分投入量为 N 600 kg/ hm²、P2O5 300 kg/hm²、K2O 300 kg/hm²。
采用五点取样法采集 0～20 cm 耕层土壤样本，混合均匀后运回实验室，去除可见的凋落物和根，然后将土壤研磨至过 2 mm 筛，将采集的每个土壤样品分成两部分，分别放入标记好的自封袋中。一部分土样置于-80℃冰箱中保存，用于土壤微生物测序；另一部分放于 4℃储存，用于测定土壤 pH、有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷、速效钾、总盐量等指标。
1.3 指标分析
1.3.1 土壤理化性质测定
土壤理化性质的测定参照鲍士旦[15]的方法：土壤 pH 值采用 pH 计（土水比 1∶2.5）测定；全氮采用凯式蒸馏法测定；全磷采用氢氟酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法测定；全钾采用氢氟酸-高氯酸消煮、火焰光度法测定；碱解氮采用氢氧化钠-硼酸碱解扩散法测定；有效磷采用 0.05 mol/L 盐酸、0.025 mol/L 硫酸浸提-分光光度法测定；速效钾采用火焰光度法测定；有机质含量采用重铬酸钾-硫酸外加热方法测定；总盐量采用超纯水浸提-烘干法测定。
1.3.2 DNA 提取与高通量测序
土壤样品的总 DNA 提取按照 E.Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒说明书进行，测定提取 DNA 的浓度和纯度，于-80℃保存待用。细菌使用引物 515F 和 806R 扩增 16S rRNA 基因的 V3～V4 区。为了尽量减少扩增偏差，每个样品都进行了 3 次单独的聚合酶链式反应扩增。构建的扩增子文库在上海凌恩生物公司 Illumina Novseq 6000 平台上完成测序。测序下机后的原始数据使用 R 软件的“DADA2” 包进行序列质检、过滤与裁剪、序列拼接和去除嵌合体。最后，高质量的序列聚类为扩增子序列变体 （ASVs），采用 SILVAv132 数据库对细菌的 ASVs 表进行分类注释。
1.4 统计分析
采用 Excel 2021 进行数据的记录与统计分析，采用 SPSS 21.0 进行单因素方差分析（P<0.05），采用 R 4.2.3 进行细菌群落组成与环境因子的典型相关性分析（CCA）和热图制作。利用 Mothur 计算 Shannon 多样性指数与 Chao1、Ace 丰富度指数，用于评价细菌α多样性。基于 Bray-Curtis 矩阵，群落差异检测使用 R 包 vegan 中的 adonis 进行置换多元方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同种植年限对土壤化学性质的影响
由表1可知，不同种植年限对土壤化学性质有显著影响。随着大棚使用年限的增加，有机质呈上升趋势，与速效钾变化规律相反，但处理间的差异不明显；全钾、全磷及有效磷处理间无明显变化规律。土壤 pH 降低，其中种植 20 年的土壤 pH （5.11）低于种植 10 年的大棚（5.56），显著低于 CK（5.85）。碱解氮、全氮随着种植年限的增加呈上升趋势，种植 20 年后显著高于 CK（P<0.05），其含量分别为 222.40 mg/kg、1.68 g/kg，分别比 CK 增加 84.99%、30.23%。土壤总盐量在种植 10 年时达到最高值（3.27%），较 CK 提高 1.3%（P<0.05）。
表1不同种植年限土壤的化学性质
注：不同处理之间的显著差异用不同小写字母表示（P<0.05，n=3）。下同。
2.2 不同种植年限对土壤细菌群落多样性的影响
利用高通量测序技术，对 9 个土壤样品进行分析，按最小样本序列数抽平，以 97% 的相似度进行聚类划分，共有 4677 个操作分类单元（OTU）。归类于 43 个门，122 个纲，273 个目，425 个科， 769 个属。不同处理的细菌覆盖率均高于 99.12%，达到解释土壤细菌多样性的要求，能够较全面反映样品土壤细菌群落的真实情况。由表2可知，土壤细菌的 Chao1 指数、Shannon 指数、Ace 指数在种植 10 年时与 CK 差异不显著，但在种植 20 年后要显著低于 CK 与种植 10 年处理（P<0.05）。这说明设施蔬菜种植 20 年会显著降低土壤细菌α多样性。
表2土壤不同使用年限细菌群落α多样性指数
注：Chao1、Ace、Shannon 为α多样性指数。下同。
2.3 不同种植年限对土壤细菌群落结构的影响
采用高通量测序和分类学对土壤样品进行分析（图1a）。基于物种注释结果，在门水平上选择相对丰度最大的前 10 个菌门，绘制相对丰度柱状图。分析结果表明，不同种植年限的土壤中主要菌门包括变形菌门（Proteobacteria，20.69%～27.57%）、酸杆菌门（Acidobacteriota，18.27%～19.01%）、绿弯菌门（Chloroflexi，8.26%～30.40%）、拟杆菌门（Bacteroidota，3.41%～11.48%）、浮霉菌门 （Planctomycetota，3.23%～10.49%）、疣微菌门 （Verrucomicrobiota，3.20%～9.40%）、放线菌门 （Actinobacteriota，2.67%～6.96%）、芽单胞菌门 （Gemmatimonadota，1.34%～3.80%）、厚壁菌门 （Firmicutes，1.19%～4.40%）和黏菌门（Myxococcota， 0.75%～2.07%）。其中，变形菌门占比最大，其次是酸杆菌门。对不同种植年限土壤样本中的细菌门水平进行显著性分析（图2a）发现，随着种植年限的增加，酸杆菌门、放线菌门、变形菌门和芽单胞菌门的相对丰度均呈降低趋势。其中，变形菌门的下降幅度最为显著（P<0.05），种植 20 年的样本相对丰度为 20.69%，较 CK 降低了 6.88%。与此同时，绿弯菌门和厚壁菌门的相对丰度则呈现相反的变化趋势。种植 20 年的样本中，绿弯菌门和厚壁菌门的相对丰度分别为 30.40% 和 4.40%，分别较 CK 显著增加了 22.14% 和 3.21%（P<0.05）。此外，浮霉菌门和黏菌门的相对丰度表现出先升高后降低的趋势。在 3 个种植年限的样本中，浮霉菌门的相对丰度分别为 8.50%、10.49% 和 3.23%，黏菌门的相对丰度分别为 1.72%、2.07% 和 0.75%。在种植 20 年的样本中，这两个菌门的相对丰度均显著低于 CK（P<0.05）。
图1不同种植年限下细菌群落组成门水平（a）、属水平（b）
图2不同种植年限下细菌群落前 10 门水平不同处理的显著性（a）前 10 属水平不同处理的显著性（b）
注：箱上不同字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。
属水平（图1b）有鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas， 1.11%～4.77%）、Thermoflavifilum（0.003%～6.71%）、Candidatus Udaeobacter（0.04%～4.55%）、 Bryobacter（1.34%～2.39%）、Vibrionimonas （0.96%～2.36%）、BacC-u-018（0%～4.68%）、 Nitrospira（0.03%～2.14%）、芽单孢菌属（Gemmatimonas，0.17%～2.11%）、Gemmata（0.37%～1.88%）、Acidibacter（0.40%～1.92%）。进一步对这 10 个属水平的显著性进行分析（图2b）。随着土壤种植年限的增加，鞘氨醇单胞菌属、芽单孢菌属的相对丰度呈降低趋势。BacC-u-018、Bryobacter、 Thermoflavifilum 这 3 种菌属呈现增加的趋势，并且在蔬菜种植 20 年时达到最高（P<0.05）。
采用 Bray-Curtis 距离算法对不同种植年限下的土壤细菌群落进行 CCA 并且结合 PERMANOVA 分析（图3），结果表明，种植年限 20 年与 CK 距离较远且不在同一象限内，说明细菌群落结构差异较大（P=0.0012），而 CK 与种植 10 年距离较近，细菌群落结构相似度较高，说明种植 20 年的蔬菜地改变了土壤细菌结构。
图3土壤化学性质与细菌群落结构组成典型相关性分析
注：SOM、TN、TP、TK、AN、AP、AK 分别为土壤有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷、速效钾。下同。
2.4 土壤化学性质与细菌群落结构相关性分析
将土壤化学性质与细菌优势门属进行热图分析 （图4）结果表明，土壤 pH 与变形菌门呈显著正相关（P<0.05）；土壤总钾与浮霉菌门呈显著正相关（P<0.05）；土壤碱解氮与绿弯菌门呈显著正相关 （P<0.05），而与放线菌门、芽单胞菌门、变形菌门呈显著负相关（P<0.05）。
图4土壤化学性质与细菌群落组成热图分析
注：salt 为总盐量。
CCA 结果表明（ 图3），CCA1 和 CCA2 累积约束解释率可达 68.51%（CCA1：46.98%，CCA2： 21.53%），表明这两个轴可捕获 68.51% 的环境因子对土壤细菌群落结构的关联信息，能有效反映环境因子对群落结构的约束作用。CCA1 轴与碱解氮呈显著正相关（P=0.011）；与 pH 呈显著负相关 （P=0.036），碱解氮与 pH 可能是影响土壤细菌群落结构组成的主要环境因子（图4）。
Pearson 相关性分析进一步表明，土壤 pH 与 Chao1 指数、Shannon 指数和 Ace 指数均呈现显著正相关（P=0.011，P=0.006，P=0.013）；碱解氮与 Chao1 指数、Shannon 指数和 Ace 指数均呈现显著负相关 （P=0.01，P=0.01，P=0.001）；土壤有机质、全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾、总盐量与细菌α多样性无显著相关性，说明土壤 pH 与碱解氮含量是影响土壤细菌多样性指数的主要环境因子（表3）。
表3土壤化学性质与α多样性的相关性分析
3 讨论
3.1 不同种植年限设施蔬菜地土壤细菌α多样性的变化
土壤细菌多样性与土壤质量密切相关，细菌多样性的减少是土壤病害发生的直接原因[16]。有研究表明，随着种植蔬菜年限的增加，细菌多样性指数降低[17-18]。本研究发现细菌 Shannon 指数和 Chao1 指数与土壤 pH 呈显著正相关，且与土壤碱解氮含量呈显著负相关。设施农业氮肥大量施用不仅造成 pH 的明显下降，还显著提高了碱解氮含量。大量的研究表明，随着种植蔬菜年限的增加，细菌多样性降低受到土壤 pH 的影响，土壤酸化是导致细菌多样性降低的主要原因[16-18]。
3.2 不同种植年限设施蔬菜地土壤细菌群落的变化
高通量测序显示，露天蔬菜地主要细菌门包括变形菌门、酸杆菌门、浮霉菌门和绿弯菌门；种植 20 年大棚主要细菌门为变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门。而 Tian 等[19]的研究认为变形菌门、酸杆菌门是土壤中的优势菌门。变形菌门在土壤中的分布广泛，主要作用是分解有机物，参与碳、氮、硫等元素在土壤环境中的循环，促进植物生长[20]。本研究发现，随着施肥年限的增加，变形菌门的相对丰度显著降低，这与土壤 pH 下降有关。这与 Zhang 等[21]的研究结果一致；与此同时，绿弯菌门的相对丰度随着种植年限的增加而显著增加，这可能同样受到土壤 pH 下降的影响（图4）。绿弯菌门更适宜在酸性土壤中生长[14]。此外，相关研究发现，芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属是有益菌属。芽单孢菌属可以将土壤中的 N2O 还原为硝酸盐，有促进植物生长、抑制疾病的作用[22]；鞘氨醇单胞菌属则可以降解化学杀虫剂[23]。然而，本研究结果表明，长期种植设施蔬菜会导致土壤中芽单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属的显著减少。因此，长期种植设施农业可能会导致重要功能细菌类群的减少，进而降低土壤质量。
结合 CCA（图3）发现种植 20 年设施蔬菜地显著改变了土壤细菌群落结构，这与赵辉等[24] 的研究一致。土壤细菌群落结构受土壤养分、外部温度、水分含量及土壤的酸碱度等多种环境因素的影响[25]。经过长期设施蔬菜地种植引起土壤酸化显著降低变形菌门丰度，增加绿弯菌门丰度（P<0.05）；以氮素为主的营养元素积累导致变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、鞘氨醇单胞菌属、芽单孢菌属丰度显著减少；但增加了绿弯菌门丰度（P<0.05）。土壤微生物在能量流动、有机质转化、养分循环、污染物降解、作物抗逆性提升及抑制土壤传播疾病等方面发挥着至关重要的作用[26-28]。而土壤细菌群落结构直接反映了土壤的生物学功能，与作物的生产力紧密相关[29-30]。变形菌门丰度降低、芽单孢杆菌、鞘氨醇单胞菌等有益菌属的降低主要受到土壤 pH、氮肥施用的影响。因此，减少氮肥施用量，维持土壤酸碱平衡，对改善土壤细菌群落结构 / 激活土壤固有的生物功能 / 解决长期设施生产系统中出现的问题具有重要意义。
3.3 土壤化学性质对细菌群落的影响
土壤作为自然界中不可或缺的栖息地，其理化性质在根本上调节土壤微生物的群落结构和功能。研究结果表明，大多数细菌的分布与土壤化学性质高度相关（图4），这一发现与姚丽娟等[31]的研究结果一致。Spearman 相关性分析显示，多数细菌门和属与 pH、碱解氮、全钾、全氮等化学指标存在显著相关性。土壤 pH 通过影响碳、氮等元素的利用率，改变土壤微生物群落结构[32]；碱解氮为土壤细菌提供重要的能量来源，通过影响土壤细菌的生长繁殖改变土壤细菌的群落结构；土壤中全氮的含量不仅影响植物的氮素吸收，还通过影响氮的固定、矿化等过程，间接调控微生物群落的组成[33]。
本研究中，全钾与黏菌门、浮霉菌门呈显著正相关（P<0.05），与拟杆菌门呈显著负相关 （P<0.05）；全氮与放线菌门、芽单胞菌门、变形菌门呈显著正相关，与绿弯菌门呈现显著负相关 （P<0.05）。这些结果表明，土壤化学性质的改变可能是导致土壤细菌群落结构变化的主要因素，但具体哪个环境因子主导还存在较大争议。Zhang 等[34]的研究表明土壤中有机碳及种植年限的影响也会影响土壤细菌群落组成；石广萍等[35]发现土壤全磷是影响细菌群落结构变化的主要环境因子。Li 等[36]的研究则表明，在青藏高原盐碱地中，高盐分含量会显著改变土壤的细菌群落结构。然而本研究通过 CCA 分析发现总盐量不是影响土壤细菌群落的环境因子，而碱解氮和 pH 才是影响细菌群落组成的关键因素。这种现象的出现可能与铵根离子和钾离子在土壤总盐中的较高比例有关，尤其是铵根离子的贡献较大。
4 结论
经过 20 年设施蔬菜地种植后造成土壤酸化，全氮和碱解氮累积，导致细菌α多样性降低，细菌群落结构发生变化；种植 20 年后变形菌门丰度下降，厚壁菌门、绿弯菌门丰度增加；有益菌芽单孢菌属、鞘氨醇单胞菌属丰度显著降低，pH 降低、碱解氮含量增加或是导致细菌群落发生变化的主要环境因子。因此，在设施农业的管理过程中，应注意合理施肥适当减少氮肥用量、增加碱性物料，维持土壤酸碱性和氮素的平衡，以防止设施大棚土壤质量退化。