摘要
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为农业生产中广泛应用的益生菌，其高效增殖对微生物菌剂效能发挥至关重要。研究旨在明确微藻对枯草芽孢杆菌的促生潜力及最适作用浓度，筛选具有显著促生效果的微藻株并解析其作用方式。以极端环境分离的微藻与枯草芽孢杆菌为试验材料，通过初筛获得 6 株促生作用显著的藻种。并经 18S rDNA、16S rDNA 序列分析鉴定，6 株藻种分别属于索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana）、鱼腥藻（Anabaena sp.）、栅藻（Pseudospongiococcum sp.）。设置 0%（对照 CK）、20%、40%、60%、80%、100% 浓度梯度，微藻的活藻培养液、上清液、浓缩液、破碎液处理，研究其对枯草芽孢杆菌生长的促进作用。结果表明，索罗金小球藻 CCAXNU-001 的浓缩液促生作用最为显著，随分泌物浓度升高，促生效应呈先增强后减弱的趋势，60% 浓度时促生效果最佳，超过该阈值后作用减弱。微藻可溶性分泌物可显著促进枯草芽孢杆菌的增殖，其中浓缩液处理的促生效果优于活藻培养液、上清液和破碎液。研究明确了微藻对枯草芽孢杆菌的促生作用及浓度效应，为开发基于微藻-益生菌的高效微生物制剂提供了理论依据。
Abstract
As a probiotic widely used in agricultural production，the efficient proliferation of Bacillus subtilis is crucial for the effectiveness of microbial inoculants．This study aimed to clarify the growth-promoting potential of microalgae on B. subtilis and the optimal concentration，screen microalgal strains with significant promoting effects，and analyze their action modes． Using microalgae isolated from extreme environments and B. subtilis as experimental materials，six microalgal strains with significant growth-promoting effects were obtained through primary screening．Identified by 18S rDNA，16S rDNA sequence analysis，the six strains belonged to Chlorella sorokiniana，Anabaena sp.，and Pseudospongiococcum sp．（Note： Pseudospongiococcum is a newly proposed genus）．Concentration gradients of 0%（control CK），20%，40%，60%， 80%，and 100% were set up，using live algal culture solutions，supernatants，concentrated solutions，and lysates of microalgae to study their promoting effects on B. subtilis growth．The results showed that the concentrated solution of Chlorella sorokiniana CCAXNU-001 exhibited the most pronounced growth-promoting effect．With the increase in secretory concentration，the promoting effect first increased and then decreased，reaching the optimal effect at 60%，after which the effect weakened．Soluble secretions of microalgae significantly promoted the proliferation of B. subtilis，with the concentrated solution treatment outperforming live algae，supernatants，and lysates．This study clarified the growth-promoting effect and concentration-dependent response of microalgae on B. subtilis，providing a theoretical basis for developing efficient microbial formulations based on microalgae-probiotic combinations.
Keywords
中国是一个农业大国，土壤资源丰富，但长期以来由于过度耕作、不合理施肥、水土流失等原因，部分地区土壤退化严重。近年来，我国政府高度重视土壤的改良研究，采取了一系列措施来改善土壤质量，主要包括推广有机肥替代化肥、生物制剂、减少化学肥料的使用，提高土壤有机质含量和改善土壤微生物环境。生物肥料是一类含有有益微生物的制品，在为作物提供养分、调节有机质动态、增强土壤生物活性等方面起着重要作用，是化学肥料的有效替代品[1]。与化学肥料相比，生物肥料能减少环境污染并提升土壤的可持续性，各种促进植物生长的微生物已被用作生物肥料，如芽孢杆菌和藻类[2-3]。
荒漠微藻（包括蓝藻）是成功适应各种环境的单细胞或多细胞微生物[4]。微藻能分泌多种生物活性物质（如氨基酸、维生素和微量元素），这些物质可直接被植物吸收、改善土壤结构并提升作物的产量与品质[5-8]，微藻的胞外代谢物具有重要的生态意义。例如，微藻释放出大量溶解有机物质，不仅是细菌的能量来源[9-10]，还能通过增加有益微生物抑制病原菌，减少植物病害的发生，对于改善土壤有一定的实践意义[11]。枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）作为近年来农业生产中广泛应用的生物菌肥，施入土壤后可产生多种生物活性物质，具有调节土壤微生态、提高土壤酶活性、促进作物生长等功能[12]。张琳颖等[13]研究发现，接种枯草芽孢杆菌，土壤中的菲可以通过自然挥发、微生物降解、植物根系降解、植物吸收累积等途径得以去除，其中微生物在降解过程中发挥了重要作用[14]。微藻的某些代谢物也可促进某些细菌的生长繁殖[15]，由于藻菌协同可调节微生物群落平衡，因此，能有效控制土壤中的病害菌的滋生，在农业生产中已经成为重要的益生菌[16]。
藻与细菌的相互作用是微生物群落构建和物质循环的重要环节，二者通过分泌代谢产物形成共生或互生关系：微藻通过光合作用合成的溶解有机碳（如多糖、氨基酸）可为异养细菌提供碳源和生长因子，而细菌则可通过降解有机物、释放矿物质营养促进微藻生长[17]。近年来，这种藻菌协同效应在农业微生物制剂开发、污染物降解及生态修复等领域展现出巨大潜力，成为微生物互作研究的热点方向。研究表明，蓝藻等微藻类与芽孢杆菌的协同作用可显著增强土壤有机质的降解效率，并提升植物对磷、钾等养分的吸收能力[7-10]。固氮蓝藻与植物根际促生菌的联合应用可显著提高作物氮素的吸收效率，小球藻分泌物对病原菌的抑制作用也被证实与细菌群落结构改变相关[18]。而枯草芽孢杆菌通过分泌伊枯草素和芬荠素类抗菌脂肽，可协同抑制病原菌并诱导植物系统抗性[19]。藻菌相互作用受到越来越多的关注和研究，微藻对枯草芽孢杆菌配施的促进效果尚不明确。
本研究以极端环境（如干旱、高盐）来源的荒漠微藻为试验材料，结合高通量筛选技术，定向分离对枯草芽孢杆菌生长具显著促进作用的藻种；通过构建微藻上清液、活藻及藻细胞破碎液与枯草芽孢杆菌的共培养系统，定量评估微藻对益生菌生长的调控效应，并进一步鉴定荒漠微藻次级代谢产物 （如多糖、脂肽等）中关键活性成分及其对土壤益生菌功能的影响机制。
1 材料与方法
1.1 材料
藻种：由新疆特殊环境藻类资源种质库提供。培养基：BM 培养基，pH 7.2。
菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。培养基：NB 培养基，蛋白胨 10.0 g/L、牛肉浸粉 3.0 g/L、氯化钠 5.0 g/L、pH 7.2±0.2。
1.2 方法
1.2.1 藻悬液的制备
微藻细胞经紫外分光光度计（OD680）和光学显微镜计数检测后，扩培至细胞生物量为 1×104 个 /mL 的藻液 3 L，继续培养至细胞密度达 5×107 个 /mL，取藻液于 6000 r/min 离心 5 min，收集沉淀（活藻）与上清液；上清液经 0.22 µm 滤膜抽滤得藻上清液，沉淀重悬后超声破碎得破碎液，将微藻不同处理按 0%（对照 CK）、20%、40%、60%、 80%、100%（原液）浓度梯度，分装至离心管备用。
1.2.2 菌悬液的制备
称取 NB 培养基 18 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中， 121℃灭菌 15 min；取 10 mL 活化后的枯草芽孢杆菌加入 100 mL 液体培养基中，37℃培养 16 h，每隔 2 h 测定 OD600 值、绘制生长曲线[20]。
1.2.3 微藻对枯草芽孢杆菌生长的影响
将枯草芽孢杆菌按 10%（10 mL）接种至培养基中，37℃恒温培养。待进入对数生长期时，分别取 0、20、40、60、80、100 mL 菌液，10000 r/min 离心 10 min，弃上清后用无菌水洗涤菌体 2 次[21]，将不同浓度 0%、20%、40%、60%、80%、100% 的藻悬液分别加入菌体中，充分摇匀后倒入原培养液继续培养，并定时测定吸光度。
1.2.4 序列分析
将分离纯化的单藻种扩大培养后，使用日本 Nikon Ni-E 微分干涉显微镜（DIC）观察藻细胞形态进行形态鉴定。采用 Ezup 柱式植物基因组 DNA 提取试剂盒提取藻种 DNA，用真核绿藻通用引物 18S rDNA（蓝藻通用 16S rRNA）扩增目的片段。测序后将序列上传至 NCBI 数据库比对分析。
1.3 数据分析
用 Excel 2010 进行数据处理和绘图。采用 SPSS 18.0 进行双因素方差分析，LSD 法进行差异显著性检验。P<0.05 视为差异显著。
2 结果与分析
2.1 微藻的鉴定
藻类形态学鉴定是微藻分类及系统地位确定的基础，结合分子生物学方法可显著提升鉴定准确性。显微镜及扫描电镜观察结果（图1、2）显示，CCAXNU-001 为椭圆形单细胞（长 5～10μm），具单个蛋白核，杯状色素体形态；CCAXNU-002 为蓝绿色直形藻丝（宽约 2μm），无分支及异形胞结构；CCAXNU-003 为椭圆形单细胞，具单个蛋白核、周生色素体且细胞一端具乳状突起；CCAXNU-004 与 CCAXNU-005 为球形或椭圆形（长 3～6μm），具单个蛋白核、杯状色素体及厚细胞壁；CCAXNU-006 为椭圆形单细胞（长 3～6μm），细胞壁薄厚不一，单个蛋白核及杯状色素体形态。基于上述特征，初步鉴定 CCAXNU-002 为丝状蓝藻（Oscillatoria sp.），其余藻株（CCAXNU-001、CCAXNU-003～CCAXNU-006） 符合椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea）的典型特征。
2.2 微藻的序列分析
基于 18S rDNA 序列分析（测序长度≥ 1500 bp），使用 BLASTn 在 NCBI 数据库进行比对显示，CCAXNU-001 与索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana，KP771817） 序列的相似性为98.95%；CCAXNU-002被鉴定为鱼腥藻（Anabaena sp.），其 16S rDNA 序列与柱孢鱼腥藻 （Anabaena cylindrica，NR_074299）的相似性为 99.02%； CCAXNU-003 与栅藻（Scenedesmus sp.，MT984304） 的相似性为 99.10%；CCAXNU-004、CCAXNU-005、 CCAXNU-006 与索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana， KU948990）的相似性为 98.90%；采用 MEGA 11.0，以最大似然法构建系统发育树（图3），明确各藻株的系统分类地位。
图16 株微藻细胞的光学显微镜观察图
图26 株微藻细胞扫描电镜图
图3藻种基于 18S rDNA 的系统发育树
2.3 微藻与枯草芽孢杆菌生长曲线
将 6 株藻种（CCAXNU-001～CCAXNU-006） 按 1∶1 接种密度接种于 BM 培养基，于 30℃，5000 lx 光照强度，12h∶12h 光暗循环条件下培养，每日定时测定细胞密度（图4）。培养初期（1～3 d），各组藻细胞生长无显著差异（P>0.05），第 4 d 时， CCAXNU-001 与 CCAXNU-004 藻株率先进入对数生长期，其余藻株的生长延滞期持续至第 5 d；至第 11 d 时，CCAXNU-001 藻细胞密度达峰值（4.764× 107 个 /mL），显著高于其他试验组（P<0.05）。随后所有藻株均进入衰亡期，细胞密度呈下降趋势。
图46 株微藻生长曲线
采用紫外可见分光光度计检测枯草芽孢杆菌培养过程（0～16 h）的 OD600 值（图5），其生长曲线呈现典型四阶段特征：0～2 h 为迟缓期，菌体生长缓慢（OD600 值≤ 0.2）；2～12 h 进入对数期，生物量呈指数增长（R²=0.98）；12～14 h 为稳定期，OD600 值维持在 1.85±0.03；14 h 后进入衰亡期，菌体密度显著下降（P<0.05）。结果表明，枯草芽孢杆菌最适收获时间为对数期末期（12 h），此时菌体代谢活性及目标产物积累达到峰值。
图5枯草芽孢杆菌生长曲线
2.4 微藻对枯草芽孢杆菌生长的影响及促生藻株筛选
通过 300 株荒漠藻与枯草芽孢杆菌的共培养试验筛选（图6），发现不同藻株对细菌生长存在显著差异。CCAXNU-001 至 CCAXNU-006 藻株表现出显著促生效果（P<0.01），与 CK 相比，各处理组细菌生物量分别提高 84.2%±3.5%、86.1%±2.8%、87.4%±3.1%、 94.0%±2.6%（最大促生效应）、93.2%±2.9%、89.7%± 3.3%。推测其促生机制可能与微藻分泌的生长促进因子（如维生素 B 族、吲哚乙酸等）有关。部分藻株 （如 CCAXNU-135、CCAXNU-170 等）表现出抑制倾向，但未达统计学显著水平（P≥0.05）。
图6促进枯草芽孢杆菌生长的微藻大量筛选分析
2.5 微藻浓度梯度对枯草芽孢杆菌生长的影响
6 株微藻处理均显著促进枯草芽孢杆菌生长 （P<0.05，图7），其生物量（OD600 值）呈典型“S” 形增长曲线且存在藻株间差异：CCAXNU-003、 CCAXNU-005 处理组提前于 2 h 即进入对数期，促生作用显著强于 CCAXNU-001、CCAXNU-002、 CCAXNU-004 和 CCAXNU-006 处理组（4 h 进入对数期）。
图76 种微藻不同浓度处理对枯草芽孢杆菌生物量的影响
各处理组在 14～16 h 达到生物量峰值（表1），其中 CCAXNU-005（60%）处理组促生作用最优，较 CK 提高 96.12%±2.67%（P<0.01）。CCAXNU-001（60%） 和 CCAXNU-003（80%）分别提高 87.33%±2.15% 和 88.34%±1.98%（P<0.01）。浓度梯度分析揭示，60% 为 CCAXNU-001、CCAXNU-002、CCAXNU-004、 CCAXNU-005 的最佳促生浓度，而 CCAXNU-003 的最优促生浓度为 80%。比较分析表明，CCAXNU-005 藻株在 60% 浓度下兼具促生时效优势（2 h进入对数期）与强度优势（生物量提升 96.12%）。这为构建藻-菌协同代谢体系提供了关键理论依据。
表1微藻不同浓度处理对枯草芽孢杆菌生物量的影响
注：数据表示为均值 ± 标准差，n=3；生物量提升和显著性为处理与对照相比。
2.6 微藻不同处理方式对枯草芽孢杆菌生长的影响
不同处理方式对枯草芽孢杆菌生长的影响呈现显著差异（图8）。所有处理组均在培养 2 h 后进入对数生长期，其中对照组的比生长速率为 0.48 h-1。各组均在 14～16 h 达生物量稳定期。60% 浓度的微藻浓缩液处理的促生作用最为显著，菌落数达峰值 4.68×108 CFU/mL，较 CK 提升 92.15%（P<0.01），显著高于活藻（87.33%）、上清液（78.56%）及破碎液（72.34%）处理（P<0.05）。值得注意的是，当处理浓度超过 60% 时，促生作用呈下降趋势，推测与高浓度代谢产物（如胞外多聚物）的反馈抑制相关。试验首次证实微藻次级代谢产物是驱动枯草芽孢杆菌增殖的核心因子，其促生强度排序为浓缩液＞ 活藻＞上清液＞破碎液，为藻-菌复合制剂的开发提供了关键参数（浓度阈值 60%）。
3 讨论
藻菌互作作为土壤微生物群落构建的核心机制，在维持生态系统物质循环与功能稳定中发挥关键作用[17]。微藻通过光合作用合成的胞外有机碳（如多糖、氨基酸）可为异养细菌提供碳源与生长因子，而细菌的代谢活动则能释放矿物质营养并改善微藻生境，形成协同增益的互生关系[22]。我国土壤退化问题呈现显著地域分异特征，北方干旱半干旱区的盐碱化与南方红黄壤区的酸化，均伴随土壤微生物群落失衡与功能衰退[21]。在此背景下，解析藻菌协同机制对开发高效生物修复技术具有重要意义。本研究发现，荒漠微藻 （CCAXNU-001 至 CCAXNU-006）对枯草芽孢杆菌具有显著促生作用（P<0.05）。经分子鉴定，这些藻种分别为索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana，KP771817）、鱼腥藻（Anabaena sp.） 和栅藻（Scenedesmus sp.， MT984304）。这一发现与王园园[23] 关于小球藻促进好氧微生物生长的研究结果相印证。试验数据显示，60% 藻液浓度对枯草芽孢杆菌的促生作用最佳，其中 CCAXNU-001 微藻的浓缩液处理使菌落数达到峰值 4.68×108 CFU/mL，较 CK 提升 92.15%。这一现象可能与微藻分泌的胞外多聚物有关，这些富含多糖和蛋白质的物质不仅为微生物提供营养[24]，还能改善土壤微环境。进一步研究发现，不同处理方式的促生作用存在显著差异（P<0.05），表现为浓缩液 >活藻 >上清液 >破碎液。这与 Sharma 等[25]关于微藻活性物质释放的研究结果一致。值得注意的是，当浓度超过 60% 时促生作用有所下降，这可能与代谢产物的反馈抑制有关。Elarroussia 等[26]的研究证实，微藻提取物中的多糖类物质具有显著的生物刺激作用。藻菌互作机制的研究表明，微藻通过光合作用合成的胞外有机物为枯草芽孢杆菌提供了优质碳源[27]，而细菌的生长又促进了养分循环，形成正向反馈。这种互作不仅提高了物质周转速率，还通过创造更多生态位缓解了微生物间的竞争[28]，为构建健康的土壤微生物网络奠定了基础。
图8CCAXNU-001 代谢物不同浓度处理对枯草芽孢杆菌生物量的影响
目前，关于藻类次级代谢产物对土壤益生菌影响的研究尚属新兴领域。本研究发现的选择性促生藻株及其代谢产物，在调节土壤养分、优化微生物群落结构等方面展现出巨大潜力。未来研究应着重于：1）解析特定代谢产物的作用机制；2）优化藻菌配比以提高协同效应；3）评估田间应用的长期效果。这些工作将为开发新型生物土壤改良剂提供理论依据和技术支持。
4 结论
本研究从极端环境荒漠微藻中筛选出 6 株对枯草芽孢杆菌具有显著促生效应的藻株，经分子鉴定显示 CCAXNU-002 为鱼腥藻（Anabaena sp.），其余 5 株均为索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana）。其中 CCAXNU-001 藻株在 60% 处理浓度下促生效果最优，使枯草芽孢杆菌生物量提升达 92.15%（P<0.01）。试验证实不同处理方式促生效应的强弱关系为浓缩液＞活藻培养液＞ 上清液＞破碎液（P<0.05），揭示微藻分泌的次级代谢产物是藻-菌互作的关键介质。研究成果首次阐明极端环境微藻对益生菌的促生机理，为开发微藻-菌群协同的土壤改良技术提供了理论依据和优质藻种资源，对解决农业土壤退化问题具有重要应用前景。