摘要
为探究解淀粉芽孢杆菌和不同矿物质添加对堆肥过程中木质纤维素降解、腐殖质形成和微生物多样性的影响。以鸡粪和木屑为原料，设置 5 个处理，分别为对照（CK）、添加基于物料干重 2% 解淀粉芽孢杆菌（T1）、 2% 解淀粉芽孢杆菌 +10% 膨润土（T2）、2% 解淀粉芽孢杆菌 +10% 麦饭石（T3）和 2% 解淀粉芽孢杆菌 +10% 海泡石（T4），通过监测温度、木质纤维素、腐植酸和细菌多样性等指标，分析解淀粉芽孢杆菌和矿物质对堆肥过程的影响。结果表明，T2、T3 和 T4 处理半纤维素显著降低 12.63% ～ 18.44%（P<0.05），纤维素含量显著降低 10.48% ～ 12.59%（P<0.05），其中 T3 处理效果最好（半纤维素和纤维素含量分别降低 18.44% 和 12.59%）；T2、 T3、T4 处理腐植酸和胡敏酸含量分别显著上升 4.94% ～ 6.17%（P<0.05）和 11.54% ～ 15.38%（P<0.05），其中 T3 处理效果较好（腐植酸和胡敏酸含量分别上升 6.17% 和 15.38%）。与 CK 相比，T2、T3 和 T4 处理胡敏酸与富里酸比值（HA/FA）分别显著升高 16.91%、23.54% 和 12.77%（P<0.05），此外，所有处理的 HA/FA 在第 14 d 后均高于 1.6，表明腐熟过程得到有效促进，且在第 14 d 后种子发芽指数均大于 80%，达到腐熟标准。细菌群落结构在堆肥过程中发生了较大变化，各处理的细菌多样性均出现了明显提高，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门 （Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）成为堆肥的优势菌群，拟杆菌门均呈现升高趋势，在 T3 处理中相对丰度较高（13.01%）。研究发现，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用能促进纤维素和半纤维素降解，加速腐殖质的形成，并将腐熟时间缩短至 14 d 以内，其中解淀粉芽孢杆菌和麦饭石的协同作用在实际堆肥应用中具有较大潜力。
Abstract
The research aimed to investigate the effects of Bacillus amyloliquefaciens and different mineral additions on lignocellulose degradation，humus formation and microbial diversity during composting. In this study，chicken manure and wood chips were used as raw materials，and five treatments were set up，including the control group（CK），with the addition of 2% Bacillus amyloliquefaciens based on the dry weight of the material（T1），2% Bacillus amyloliquefaciens+10% bentonite clay（T2），2% Bacillus amyloliquefaciens+10% mackerel（T3），and 2% Bacillus amyloliquefaciens+10% sea foam（T4）. The effect of the different minerals added on the degradation of lignocellulose and the formation of humus and microbial diversity during the composting process were analyzed through the monitoring of temperature，lignocellulose， humic acid，and bacterial diversity and other indicators to analyze the effects of Bacillus amyloliquefaciens and minerals on the composting process. The results showed that the hemicellulose of T2，T3 and T4 treatments was significantly reduced by12.63%-18.44%（P<0.05）and the cellulose content was significantly reduced by 10.48%-12.59%（P<0.05），among which the best effect was achieved by the T3 treatment（hemicellulose content was reduced by 18.44% and cellulose content was reduced by 12.59%）. The humic acid content of T2，T3 and T4 treatments was significantly increased（4.94%-6.17%，P < 0.05）and humic acid content was increased significantly（11.54%-15.38%，P < 0.05），among which the T3 treatment was more effective（humic acid increased by 6.17% and humic acid increased by 15.38%）. Compared with CK，the humic acid to fulvic acid ratio of T2，T3 and T4 treatments was significantly increased by 16.91%，23.54% and 12.77%（P < 0.05）， respectively. In addition，the humic acid to fulvic acid ratio of all treatments was higher than 1.6 after the 14th d，indicating that the humification process had been effectively promoted，and the seed germination indices were greater than 80% after 14 d，which reached the standard of decomposition. The bacterial community structure changed greatly during the composting process，and the bacterial diversity of all treatments was increased significantly，with Firmicutes，Proteobacteria， Actinobacteriota and Bacteroidota becoming the dominant bacterial groups in composting，and Bacteroidota showing an increasing trend in the composting process，with the Bacteroidota showing an increasing trend in the composting process， with higher relative abundance（13.01%）in T3 treatment. In this study，it was found that the synergistic effect of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus could promote cellulose and hemicellulose degradation，accelerate humus formation， and shorten the decomposition time to less than 14 d. The synergistic effect of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus had a greater potential for practical composting applications.
随着我国畜牧业规模化、智能化、集约化的发展，畜禽粪便污染问题日趋严峻。好氧堆肥是畜禽粪便资源转化与回收利用重要的技术之一，其通过微生物代谢将有机物转化为腐殖质[1-3]。腐植酸 （HS）主要由胡敏酸（HA）和富里酸（FA）组成，是指示堆肥成熟度和稳定性的重要参数[4]。一般来说，成熟堆肥含有较高的 HA 和较低的 FA，所以要促进 HA 的形成。而木质纤维素降解形成芳香族化合物，与还原糖和氨基酸聚合会生成胡敏酸，木质纤维素是堆肥中最稳定、最难降解的有机碳组分，其不仅限制了堆肥的快速腐熟，还限制了腐殖质的形成。因此，研究堆肥过程中木质纤维素的降解和腐殖化进程十分重要。
近年来，微生物添加剂（芽孢杆菌、白腐真菌和黄孢原毛平革菌）[5-6]和矿物添加剂（膨润土、麦饭石和海泡石）[7-9]被用于改善堆肥过程中的有机物降解和腐殖化。芽孢杆菌具有良好的纤维素降解功能及环境适应性[10]，在好氧有机堆肥过程中表现出良好的性能。付冰妍等[11]在园林废弃物堆肥过程中接种量为 2% 的菌剂发现，纤维素、木质素降解率分别提高 11.04%、15.47%。Li 等[12]研究表明，接种微生物菌剂可升高温度并缩短堆肥周期。Duan 等[13]报道，在堆肥中添加枯草杆菌可以提高其纤维素酶的分泌能力，加快其分解速率，并由此生成稳定的腐殖物质。Mei 等[14]研究发现，解淀粉芽孢杆菌 SL-7 在烟草秸秆堆肥发酵中使木质素降解率提高 11.70%～22.26%。类似于生物炭的物理特性的矿物质添加剂被广泛研究，其高比表面积可为微生物生长繁殖提供适宜的栖息环境，丰富的孔隙结构可加速氧气快速流通和能量传输，促进微生物的好氧代谢[15]。Wang 等[16]研究表明，具有大表面积和高离子交换量的矿物添加剂（伊利石、膨润土和蒙脱石）可以帮助微生物生存和繁殖，以此调控堆体微环境变化。膨润土可为微生物提供栖息地，从而促进微生物降解有机物，提高堆肥的稳定性和成熟度[8]。Wang 等[9]研究表明，与对照相比，麦饭石添加处理中半纤维素和纤维素的分解速率分别提高了 9.64%～27.08% 和 2.11%～12.07%。同时，麦饭石改良剂显著提高腐植酸含量 5.58%～9.75%。郑威等[7]研究发现，添加 10% 海泡石可提高堆肥产物中 HA 的芳香化指数，促进堆肥腐熟。已有研究探究了携带微生物的生物炭应用于山羊粪堆肥，其可延长嗜热阶段的持续时间并增强堆肥成熟度[17]。目前，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用在鸡粪好氧堆肥中的应用较为有限，其对堆肥腐殖化和木质纤维素降解的影响尚不清楚。
本研究以鸡粪为原材料，木屑为调理剂，加入解淀粉芽孢杆菌和不同的矿物质（膨润土、麦饭石和海泡石），旨在研究鸡粪好氧堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质共同添加对木质纤维素降解、腐殖化进程和微生物多样性的影响，以期为今后解淀粉芽孢杆菌和矿物质协同添加对鸡粪堆肥技术的影响提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验研究地点位于北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所温室（116.28°E，39.94°N）。堆肥主料为鸡粪（北京市密云区北庄镇朱家湾村凯诚音乐农场提供），调理剂为木屑，来源于北京周边农场，膨润土、海泡石、麦饭石购自河北省石家庄灵寿县帝航矿产品有限公司，解淀粉芽孢杆菌由北京市农林科学院植物营养与资源环境研究所提供，其孢子含菌量为 3×108 CFU/mL。堆肥原料的特性见表1。
表1原料的基本理化性质
注：—表示未检测出，目前检测出这些天然矿物里不存在碳、氮和木质纤维素的物质；a 基于湿基质量，b 基于干基质量。
1.2 试验设计
堆肥装置为 56 L 的圆柱形金属智能发酵罐，整个装置由罐体、密封盖、海绵保温层、连续温度监测探头、滤网组成，整个堆肥系统包括发酵罐、通气设备、堆肥参数监测装置 3 部分。该发酵罐的内径为 36 cm，外径为 46 cm，内高为 55 cm，外高为 83 cm，并有 5 cm 厚的保温材料以减少热量损失。堆肥罐底部放置了不锈钢筛板来支撑堆肥材料，使空气扩散均匀，并为渗滤液的排放提供空间。本堆肥试验将鸡粪和木屑按照干重 3∶2 混合均匀作为基质物料，共设置 5 个处理，添加鸡粪和木屑（对照，CK）、添加基于物料干重 2% 的解淀粉芽孢杆菌 （T1）、2% 的解淀粉芽孢杆菌 +10% 膨润土（T2）、 2% 的解淀粉芽孢杆菌 +10% 麦饭石（T3）和 2% 的解淀粉芽孢杆菌 +10% 海泡石（T4），使其初始碳氮比（C/N）为（25±2）∶1，含水率为（60±5）％来促进腐熟，减少碳氮损失，每个处理 3 个重复，堆肥期间采取强制通风 + 人工翻堆方式进行供氧，以 0.2 L/（kg·min）通风速率从堆肥罐底部进行间歇通风（通风 30 min、停止 30 min）。各处理采用等干物质质量装填法，确保初始堆肥原料的干重一致。具体操作如下：将预混好的堆肥原料（主料 + 辅料） 按相同湿重称量后装入发酵罐，同时测定初始含水率，并通过干质量换算公式[干质量＝湿重 ×（1-含水率）]调整装填量，以保证各处理的干物质质量相同。膨润土、麦饭石和海泡石等添加剂按试验设计比例额外添加，其质量纳入总装填量计算。若因堆肥过程中的物料损失导致实际装填量存在差异，所有检测数据均以单位干物质质量为基础进行标准化校正，以消除质量差异对结果的影响。校正公式如下：校正后数值＝测定值 ×（发酵罐总装填干重 / 样品干重）。试验直到堆体温度稳定在环境水平下停止堆肥，进行了 28 d。
1.3 试验方法
1.3.1 样品取样方法
于堆体上、中和下部采集共 300 g 的固态样本，将样品分为 3 个部分，其中一部分用来检测鲜样品指数；另一部分采用自然风干、粉碎、过筛法进行测定；其他部分被储藏在-20℃的冷冻箱中用于后续的分析。
1.3.2 温度测定
室温和堆体温度由精创温度记录仪 Tlog100EC 测定（测定堆体中部温度），每间隔 10 min 自动记录一次，取一天记录的平均温度。
1.3.3 有机碳的测定
在 0、5、7、10、14 和 28 d 取样，采用重铬酸钾容量法测定，参照 NY/T525—2021。
1.3.4 纤维素取样及测定
在 0、5、14 和 28 d取样进行木质纤维素含量（半纤维素、纤维素和木质素）的测定，根据 Van Soest 等[18] 描述的方法进行。每个处理测定 3 次。
1.3.5 腐殖质取样及测定
在 0、5、14 和 28 d 取样进行堆肥 HS、FA 与 HA 测定，使用 0.1 mol/L Na4P2O7·10 H2O 和 0.1 mol/L NaOH 的混合物，以 1∶10 的比例从堆肥样品中提取 HS[19]。将 HS 上清液 pH 调节至 1.5，并允许过夜，通过离心获得 FA，用 0.05 mL H2SO4 洗涤后，将沉淀的 HA 溶解在 0.1 mol/L NaOH 中。使用总有机碳分析仪，确定 HS、HA 和 FA 的有机碳含量。每个处理测定 3 次。
1.3.6 种子发芽指数（GI）取样及测定
在 0、5、7、10、14 和 28 d 取样，准确称取堆肥鲜样 2.000 g，与 20.00 mL 蒸馏水混合，置于恒温振荡器中振荡 30 min，随后离心过滤，取 5 mL 上清液置于铺垫 9 cm 定性滤纸的培养皿中，待没有气泡后向培养皿中放置 10 粒萝卜（未包衣）种子为试验材料，以等量蒸馏水做空白对照。在 25℃固定温度条件下黑暗培养 48 h，测定各培养皿中发芽种子个数和根长。该指标测定时所需试验器皿均通过高温灭菌处理。计算公式如下：
1.3.7 微生物多样性
在第 0、5 和 28 d从堆肥样本中提取总基因组 DNA（Meta-G-Nome 提取试剂盒）。使用细菌正向引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGAGGCAG CA-3′） 和反向引物 806R（5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）进行细菌 16S rRNA 基因的 PCR 扩增，使用上海美吉生物制药技术有限公司的 Miseq PE300 平台（美国加利福尼亚州圣地亚哥市 Illumina 公司）进行测序。
1.4 数据分析
本研究采用 SPSS 22.0 对数据进行统计分析，采用 Origin 2021 作图，利用美吉生物云平台 （https：//www.majorbio.com/） 分析微生物多样性。采用最小显著性差异法进行显著性检验（P<0.05），结果数据以平均值 ± 标准差的形式表达。
2 结果与分析
2.1 堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质对温度变化的影响
在堆肥过程中，堆肥中的温度变化直接影响堆肥中微生物的数量，进而影响堆肥的分解速度。按照《 国家无害化卫生规范 》（GB 7959—87）， 50℃好氧堆肥需要 4～5 d 满足高温腐熟的需要。本研究中各处理温度呈现先上升后下降的趋势 （图1），温度在 14.9～68.4℃范围变化。所有处理的温度在第 1 d 迅速上升，均超过 50℃，第 2 d 达到峰值，其中 T2>T3>T1>T4>CK，分别为 68.4、 67.8、66.3、63.7 和 60.8℃。各处理堆肥达到 50℃ 的高温持续时间分别为 9 d（CK）、10 d（T1）、11 d（T2）、11 d（T3）和 11 d（T4），解淀粉芽孢杆菌和矿物质同时添加比 CK 持续时间长 2 d，其有利于延迟高温持续时间。各处理堆肥达到 60℃的高温持续时间分别为 1 d（CK）、2 d（T1）、7 d（T2）、 7 d（T3）和 4 d（T4），解淀粉芽孢杆菌和矿物质同时添加比 CK 持续时间显著延长 3～6 d。
图1堆肥过程中温度变化
注：小写字母不同表示各处理间差异显著（P<0.05）。下同。
2.2 堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质对腐殖质和种子发芽指数的影响
2.2.1 堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质对腐殖质的影响
HS 是堆肥的重要产物，也是评价堆肥质量的重要指标[20]。如图2a所示，各处理堆肥中 HS 含量均呈上升趋势，腐植酸前期上升速率较慢，可能是因为微生物优先分解易降解有机物（糖类、蛋白质）。堆肥结束时，与 CK 相比，T1 处理升高了 2.47%，T2、T3 和 T4 处理分别显著上升了 5.06%、 6.17% 和 4.94%（P<0.05），说明解淀粉芽孢杆菌和矿物质的添加加速了腐熟进程，矿物的多孔性及较大的比表面积可为腐殖化过程中的微生物活性及表面功能基团提供位置及空间[16]，形成稳定的腐植酸-矿物复合体，其中添加解淀粉芽孢杆菌和麦饭石效果较好。
HS 的主要成分是 HA 和 FA，其组分的变化会对堆肥性能产生重要的影响[21]。图2b显示 HA 呈上升的趋势，与 CK 相比，堆肥第 28 d，T1 处理上升了 3.46%，T2、T3 和 T4 处理分别显著上升了 11.73%、15.38% 和 11.54%（P<0.05），其中解淀粉芽孢杆菌和麦饭石的协同作用对于提高 HA 效果较好，这可能是因为在矿物基质表面可与阳离子桥键结合，以保证 HA 的稳定生成[22]。在整个堆肥过程中，高温阶段 HA 含量迅速上升，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的添加组 HA 增长率明显高于 CK，这一结果可以用堆肥高温期的变化来解释，高温有利于 HA 的形成和积累[23]。研究结果显示，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用能促进 HA 的发育和积累，而 HA 是衡量堆肥产品品质的标准。 FA 的变化如图2c所示，FA 与 HA 可以相互转化，在微生物的作用下，FA 会转化为结构更稳定的 HA[24]。堆肥结束时，与 CK 相比，T2、T3 和 T4 处理的 FA 含量分别显著降低了 6.89%、10.34% 和 6.89%，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的共同添加有助于堆肥过程中不稳定 FA 的分解和更稳定 HA 的形成。
胡富比（HA/FA）作为衡量堆肥腐熟程度的重要指标，能较好地反映堆肥产品的品质[25]。图2d显示了解淀粉芽孢杆菌和矿物质对好氧堆肥过程中 HA/FA 的影响。与 CK 相比，T1 处理升高了 3.55%，T2、T3 和 T4 处理显著升高 16.91%、 23.54% 和 12.77%（P<0.05）。当堆肥在第 14 d 时，各处理 HA/FA 均高于 1.6，说明堆体已经腐熟。与 CK 相比，解淀粉芽孢杆菌和不同矿物质同时添加均显著促进腐殖化程度（P<0.05），其中 T3 处理效果较好，在第 13 d 时 HA/FA 高于 1.6。
2.2.2 堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质对种子发芽指数的影响
GI 被广泛用于评估堆肥产品的植物毒性和堆肥的成熟度[26]。在堆肥初期，所有处理的 GI 值都较低，这是因为微生物有机质的分解会产生更多的铵盐和有机酸，这些物质对种子萌发有抑制作用。随着有机酸的消耗，堆体 pH 值升高，发芽指数呈快速上升趋势。如图3所示，GI 呈现升高的趋势，若 GI 超过 80%，则认为堆肥腐熟且无毒，在第 10 d 时 T2、T3 和 T4 处理的 GI 均超过 80%，分别为 93.58%、92.84% 和 88.84%，而 CK 和 T1 处理分别为 70.17% 和 78.54%； 各处理在第 14 d 后 GI 均大于 80%，这表明在第 14 d 后，堆肥腐熟且无害。
图2堆肥过程中腐植酸、胡敏酸、富里酸、胡富比变化
图3堆肥过程中和堆肥结束时种子发芽指数的变化
与 CK 相比，堆肥 28 d 时 T1 处理的 GI 提高了 11.64%，T2、T3 和 T4 处理分别显著提高了 24.33%、 21.15% 和 23.92%（P<0.05），其中 T2、T3 和 T4 处理差异不显著（P>0.05）。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用能提高堆肥的 GI，并在第 10 d 均大于 80%。
2.3 堆肥过程中解淀粉芽孢杆菌和矿物质对有机碳、半纤维素、纤维素和木质素含量的影响
堆肥过程中，所有处理的总有机碳含量均显著下降（P<0.05）（图4a），可能是由于微生物分解有机碳和 CO2 排放。堆肥结束时，堆体混合物达到高腐殖化水平，检测到最低总有机碳含量，各处理总有机碳的降低率分别为 29.31%、33.50%、39.10%、 43.50% 和 40.32%，其中解淀粉芽孢杆菌和麦饭石协同作用总有机碳降解率最高。
如图4b所示，半纤维素含量逐渐下降，直至达到稳定水平。堆肥初期，CK、T1、T2、T3 和 T4 处理的半纤维素含量分别下降 3.33%、8.03%、 13.10%、16.93% 和 11.59%，这可归因于高温和活跃的微生物活动促进了半纤维素的降解[27]。堆肥结束时 CK、T1、T2、T3 和 T4 处理的半纤维素含量分别降低了 5.23%、10.35%、16.27%、19.97% 和 14.18%，试验结果表明，半纤维素的降解主要在堆肥的高温阶段完成，降解量占半纤维素总降解量的 63.55%～84.77%，这可能是由于温度较高、微生物活性较高，更有利于半纤维素的降解[28]。与 CK 相比，T2、T3 和 T4 处理显著下降了 13.93%、 18.44% 和 12.63%（P<0.05），这表明解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用刺激了微生物活动，从而增加了半纤维素的降解，其中解淀粉芽孢杆菌和麦饭石的协同作用对半纤维素降解的效果较好。本研究与戴启鹏等[29]将牛粪和农林废弃物混合堆肥的研究结果一致，在堆肥过程中，堆肥中的微生物可以利用半纤维素作为碳源和能量来源，导致半纤维素含量降低[30]。
图4堆肥过程中总有机碳、半纤维素、纤维素和木质素的变化
图4c显示纤维素含量呈现下降趋势，且下降速率逐渐升高，呈现慢-快-慢的趋势。堆肥前期的纤维素降解率较低，这是由于纤维素通过木质素包裹在木屑结构中，使得纤维素难以与纤维素酶结合[9，31]；与半纤维素不同，在高温期时纤维素才开始降解，因为高温可以增强木质纤维素降解酶的活性；当堆肥进入冷却阶段时，微生物活性降低，纤维素降解速率降低。堆肥结束时，与 CK 相比，T1 处理的纤维素含量降低了 2.55%，T2、T3 和 T4 处理分别显著降低了 11.34%、12.59% 和 10.48%（P<0.05），其中解淀粉芽孢杆菌和麦饭石的协同作用对纤维素降解的效果较好，可能是解淀粉芽孢杆菌可以增强堆肥混合物中的通气性和颗粒结构的形成[32]，同时矿物添加剂提供的即时营养供应也可以促进微生物的代谢和生长，从而提高分解效率[33]，所以解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用更有助于纤维素的降解。
与半纤维素和纤维素不同，木质素是木质纤维素中最难降解的部分[34]，图4d显示木质素含量呈现逐渐增加的趋势，这可能是由于微生物与易利用的有机物协同作用，使有机物降解速度快于木质素下降速度，从而增加了相对木质素含量。与 CK 相比，堆肥第 28 d，T1 处理降低了 4.42%，T2、T3 和 T4 处理的木质素分别显著减少了 11.58%、15.06% 和 8.72%（P<0.05），其中添加解淀粉芽孢杆菌和麦饭石效果较好（15.06%），可能是因为解淀粉芽孢杆菌和矿物质较大的比表面积和孔隙，优化了堆肥体物理结构，为微生物的生长提供了有利条件[35]，这一结论与 Yang 等[36] 在添加土壤促进牛粪堆肥研究中所观察到的现象一致。
2.4 微生物多样性变化
2.4.1 微生物测序丰富度及多样性
如表2所示，细菌群落物种的丰富度和多样性分别用 Chao 1 和 Simpson 指数表示，对样本中提取的序列利用 OTU 进行聚类，Chao 1 指数的变化与微生物群落的丰富度成正比，数值越高，群落的丰富性越高[37]，Shannon 指数与 Chao 1 指数的作用相似，且随群落多样性的提高而增大。此外，通常用覆盖率来描述测序深度，本试验中所有样本的覆盖率均大于 0.99，说明排序数据的合理性。在本研究中，初始物料的 Chao 1 指数、Shannon 指数均较高，说明初始物料中丰富的营养物质可满足细菌的生长代谢，微生物种类和数量多，满足堆肥启动要求[38]。腐熟期所有处理的 Shannon 指数和 Chao 1 指数与初始相比均有所降低，可能是营养物质逐渐被消耗导致。Chao 1 指数具有相似的变化趋势。高温期各处理的 Chao 1指数分别是 435（CK）、503（T1）、547（T2）、524（T3） 和 580（T4），与初始物料的 Chao 1 指数相比均有所下降，可能是由于堆体温度升高导致嗜温微生物活性下降，堆体内部微生物群落结构发生改变，嗜热微生物发挥作用并占据主要地位，导致高温期细菌群落多样性下降[39]。但高温期与CK 相比，试验组 Chao 1 指数较大，可能是解淀粉芽孢杆菌和矿物质的添加丰富了堆肥过程中高温时期的微生物种群[40]。随堆肥时间的延长，温度逐渐降低，嗜温微生物重新开始代谢活动，腐熟期各处理 Chao 1 指数与高温期相比有所升高。Shannon 指数的变化趋势与 Chao 1 指数类似，腐熟期试验组各处理与 CK 相比分别增加了 20.26%（T1）、10.88%（T2）、7.33%（T3） 和 12.90%（T4）。根据 Chao 1 和 Shannon 指数可知，本试验细菌种群多样性按照先降低后逐渐升高的趋势发展。上述现象表明，解淀粉芽孢杆菌和矿物质添加下鸡粪堆肥过程中细菌群落多样性和丰富度均有一定提高，并且可以提高腐熟阶段细菌的质量。
表2不同处理在 3 个采样阶段细菌的序列数、Chao 1 指数、Shannon 指数和覆盖率
2.4.2 不同堆肥时期 PCoA 分析
基于 Bray-Curtis 距离矩阵的 PCoA 分析结果 （图5）表明，5 个处理的细菌群落在堆肥初始阶段、高温期和腐熟阶段均存在明显差异。这表明，解淀粉芽孢杆菌和矿物质的添加使堆肥中细菌群落的演替发生了显著变化。
图5堆肥初期、高温期和腐熟期的 PCoA 分析
注：a 为堆肥初期，b 为高温期，c 为腐熟期。
2.4.3 微生物群落演替的影响
为了更好地了解堆肥过程中不同时期细菌群落的变化，本试验选取初始阶段（第 0 d）、高温期（第 5 d）和腐熟期（第 28 d）3 个时期的不同处理堆肥样本进行细菌相对丰度的分析。不同处理的细菌门水平相对丰度如图6所示。厚壁菌门 （Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）是堆肥样品中最主要的 4 个微生物群落，以上这些门级细菌与农业废弃物堆肥发现的结果一致[41]。由于解淀粉芽孢杆菌的加入，使得试验组厚壁杆菌丰度高于 CK。随着堆肥进行，厚壁菌门先升高后下降，在堆肥初期易降解有机物（如糖类、淀粉、蛋白质）丰富，其能够迅速利用碳水化合物作为养分进行代谢[42]。堆肥腐熟期易降解有机物基本耗尽，剩余多为木质素等难分解物质，其代谢能力下降，导致厚壁菌门下降[43]。当堆肥进入腐熟期后，厚壁菌门的细菌活动性下降，取而代之的是变形菌门、拟杆菌门、放线菌门。拟杆菌门的相对丰度在 T3 处理中较高（13.01%），其快速分泌纤维素酶、几丁质酶，分解纤维素、半纤维素和果胶等难降解多糖。这一结果表明，解淀粉芽孢杆菌和矿物质有利于促进分解纤维素和多糖水解，这是由于其自身的性质优化了堆体的微环境，从而影响了微生物的生长和活性。本试验结果与吴凯[41]在鸡粪堆肥过程中添加有机废弃物后，细菌门水平丰度变化类似。
图6细菌门水平相对丰度
堆肥过程中复杂的微生物活动也可以借助属水平细菌丰度来呈现，本研究堆肥过程中最丰富的 20 种细菌相对丰度如图7所示。芽孢杆菌（Bacillus）、 Oceanobacillus、棒状杆菌（Corynebacterium）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）、努斯咸海鲜球菌（Jeotgalibaca）、叶瘿菌（Gallicola）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）、气球菌（Aerococcus）、库特氏菌（Kurthia）和 Aerosphaera 菌属占初始物料细菌水平的 60% 以上，与之前报道的研究结果类似[44]。高温阶段，芽孢杆菌占据细菌分布的较大比例，在 45～70℃条件下释放芽孢来抵御高温环境，且嗜温菌随堆体温度增高逐渐失活死亡，所以堆肥高温期芽孢杆菌丰度显著增加[45]。此外，芽孢杆菌在粪便堆肥过程中广泛存在，对木质纤维素在内的大分子有机物具有一定的降解能力[46]。其中，添加解淀粉芽孢杆菌和矿物质的处理在 Oceanobacillus、Sinibacillus、 norank_f__Bacillaceae、Ammoniibacillus 的丰度高于 CK，这些均与厚壁菌门相关，而门水平细菌丰度显示厚壁菌门也占据极大比例。门水平细菌丰度结果可以帮助筛选堆肥过程中优势菌种，以便后期在细菌组成较差的系统中使用，优化堆肥进程，提高堆肥产品质量。
2.4.4 环境因素关联性分析
通过相关性 Heatmap 图（图8）分析堆体中细菌属水平群落组成对不同的环境因子的影响，结果表明，温度、有机碳、纤维素、半纤维素、木质素、HS、HA、FA 和 HA/FA 与堆体细菌群落呈显著影响（P<0.05）。解淀粉芽孢杆菌的添加增加核心菌落丰度，矿物质的高比表面积和孔隙结构可为微生物生长繁殖提供适宜的栖息环境，丰富的孔隙结构可加速氧气快速流通和能量传输，促进微生物的好氧代谢，因此，细菌属水平受堆体因素影响的情况存在差异。堆体中温度与 Bacillus、 Sinibacillus 呈显著正相关（P<0.05），这可能是因为其属于嗜热菌，既能加速有机物的降解，又能通过高温杀灭病原体[47]。堆体中有机碳、FA 与肠球菌、棒状杆菌和乳酸杆菌呈显著正相关（P<0.05），这可能是因为有机碳释放促进肠球菌、棒状杆菌的增殖，加速有机物的分解，释放更多的小分子碳和腐殖化前体。木质素、GI、HS、HA 和 HA/FA 与肠球菌、棒状杆菌和乳酸杆菌呈显著负相关（P<0.05），木质素的积累和 HA/FA 升高代表着易降解碳源的匮乏，肠球菌等逐渐被寡营养型微生物取代[48]。
图7细菌属水平相对丰度
图8环境因素关联性分析
注：* 表示 0.01 ≤ P ≤ 0.05，** 表示 0.001 ≤ P ≤ 0.01，*** 表示 P ≤ 0.001。
3 结论
（1）解淀粉芽孢杆菌和矿物质的协同作用能促进纤维素和半纤维素降解，加速腐殖质的形成，改变厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门等细菌多样性，从而调节堆肥过程中微生物的代谢，并将腐熟时间缩短至 14 d 以内。
（2）在鸡粪堆肥中，解淀粉芽孢杆菌和麦饭石 （T3 处理）的协同作用对促进半纤维素、纤维素降解，促进腐植酸和胡敏酸形成的效果较好，在实际堆肥应用中更具有潜力。