摘要
通过根瘤菌与植物根际促生菌（PGPR）联合接种，探究其对 3 种甘草活性成分的影响。以甘草为材料，比较了根瘤菌单独和配施 PGPR（M9Z、M10）效果，并以不施菌作为对照（CK）。采用凯氏定氮法、索氏抽提法、苯酚-硫酸法、紫外-可见分光光度法分别测定粗蛋白、粗脂肪、总糖、总皂苷、黄酮的含量。结果表明，联合接种显著促进了粗蛋白、粗脂肪、总糖、总皂苷、黄酮等活性成分的积累（P<0.05），相比 CK 处理，联合接种的乌拉尔甘草分别提高了 49.57%、46.84%，21.02%、31.29%，21.68%、23.42%，25.10%、25.08%，15.87%、 22.06%；光果甘草分别提高了 28.14%、26.38%，25.9%、31.24%，16.41%、21.14%，23.50%、36.28%，16.20%、 19.14%；胀果甘草分别提高了 37.27%、40.33%，24.12%、18.11%，21.18%、22.48%，34.68%、31.96%，21.64%、 23.84%，并且 5 种成分呈现显著相关性（P<0.05）。根瘤菌与 PGPR 联合接种可以促进甘草活性成分的积累，为深入探究联合接种提高甘草中有效成分的机制提供理论基础。
Abstract
The effects of combined inoculation of Rhizobium and PGPR（M9Z，M10）on three active components inlicorice were investigated. Licorice was used as the experimental material. The effects of single inoculation with Rhizobium or PGPR and their combined application were compared，using non-inoculated plants as the control（CK）. The contents of crude protein，crude fat，total sugar，total saponin，and flavonoids were determined using the Kjeldahl method，Soxhlet extraction，phenol-sulfuric acid method，ultraviolet-visible spectrophotometry and spectrophotometry，respectively. The results demonstrated that combined inoculation significantly enhanced the accumulation of crude protein，crude fat，total sugar，total saponin，and flavonoids（P<0.05），Compared with CK，the combined administration of Glycyrrhiza uralensis was increased by 49.57% and 46.84%，21.02% and 31.29%，21.68% and 23.42%，25.10% and 25.08%，15.87% and 22.06%，respectively；the combined administration of Glycyrrhiza glabra was increased by 28.14% and 26.38%，25.9% and 31.24%，16.41% and 21.14%，23.50% and 36.28%，16.20% and 19.14%，respectively；the combined administration of Glycyrrhiza inflata increased by 37.27% and 40.33%，24.12% and 18.11%，21.18% and 22.48%，34.68% and 31.96%， 21.64% and 23.84%，respectively. Furthermore，these five components exhibited significant correlations with one another （P<0.05）. Combined inoculation of Rhizobium and PGPR could effectively promote the accumulation of active components in licorice，providing a theoretical foundation for further elucidating the mechanisms underlying the enhancement of effective components in licorice through combined inoculation.
中药甘草来源于豆科植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.） 或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根茎[1]。其药性缓和，具有调和诸药、止咳化痰、补脾益气等功效，抗炎、抗病毒、抗氧化等药理作用[2]，因此，甘草及其提取物常被用于食品、医药、烟草及化妆品等行业[3-6]。当前，野生甘草资源已难以满足持续增长的市场需求，供需矛盾日益尖锐，推动着甘草人工栽培规模不断扩大[7]。然而，人工种植面临着生长周期长、产量低、品质稳定性差等现实挑战[8]。特别是传统栽培技术与管理模式较为粗放，多年连作制度、化学肥料的盲目施用及施肥结构失衡等问题，不仅导致土壤养分平衡破坏、土传病害频发，更造成甘草产量下滑与品质退化，对人工种植产业的绿色可持续发展形成严重制约[9-10]。在此背景下，研发新型绿色环保肥料以改善土壤环境、提升肥料利用效率，或将成为破解连作障碍导致的产量、品质下降及土壤退化问题的关键路径[11]。
植物根际促生菌（PGPR）和根瘤菌广泛存在于根表和根内，复合接种能显著提升根瘤菌的固氮效率、促进根部发育、增强根部对矿质元素的吸收，对植物的生长发挥着至关重要的作用[12]。 Elkoca 等[13]通过将芽孢杆菌（Bacillus megaterium） 与根瘤菌共同接种于鹰嘴豆根际，其生物量、根瘤干重显著提升，提高了鹰嘴豆的固氮酶活性，进而促进了作物产量的提高，Younesi 等[14]研究表明，共同接种荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）能显著促进紫花苜蓿结瘤，再次验证了刘冠一[15]的试验结果，表明根瘤菌与适宜的 PGPR 共同接种能够产生协同效应。上述研究证实了微生物菌剂在提升药用植物产量和品质方面的巨大潜力，但当前针对微生物菌剂对甘草产量及品质调控机制的系统性研究仍存在明显空白。因此，本研究以不同种甘草为研究对象，施用不同组合的复合微生物菌剂，研究其对甘草活性成分的影响，继而筛选出施用效果最佳的菌剂组合，以期为微生物菌剂在甘草栽培中的应用提供理论依据和技术参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试植物为 3 年生乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草，由新疆农业大学马生军副教授鉴定。供试 78 号根瘤菌为温带中慢生根瘤菌（Mesorhizobium temperatum），原始编号为 CCBAU 01578[16]，根际植物促生菌 M9Z 和 M10，其中 M9Z 为伊利诺伊州类芽孢杆菌（Paenibacillus illinoisensis），M10 为剑菌属待定种（Ensifer sp.）[17]，均由中国农业大学根瘤菌研究中心陈文峰副教授惠赠。
1.2 试验仪器
表1主要仪器
1.3 试验试剂
表2主要试剂
1.4 试验方法
试验组分为空白组（CK）、根瘤菌处理组 （G）、PGPR 处理组（M9Z、M10）、复合菌处理组 （G+M9Z，G+M10），将已活化培养的根瘤菌与 PGPR 菌液（初始浓度均为 6.84×109 CFU·mL-1，混合菌按体积比 1∶1 复配[18]）按照不同分组处理，每株 10 mL 根灌于 3 年生乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草[19-21]，均于室外试验田生长 120 d 后测定其不同组分的含量。试验田土壤基本理化性质：pH 7.98，总盐 2.4 g·kg-1，有机质 3.29 g·kg-1，碱解氮 48.0 mg·kg-1，有效磷 4.4 mg·kg-1，速效钾 172.0 mg·kg-1。
1.5 测定方法
采用凯氏定氮法、索氏抽提法、苯酚-硫酸法、紫外-可见分光光度法分别测定粗蛋白、粗脂肪、总糖、总皂苷、黄酮的含量[22]。
1.6 数据分析
使用 Excel2010 对数据进行整理和预处理，采用 GraphPad Prism 9.0 作图，采用 SPSS 25.0 进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 联合接种对不同甘草粗蛋白的影响
从图1可以看出，在 G+M9Z 和 G+M10 处理下，乌拉尔甘草的粗蛋白含量与其他处理存在极显著差异，相比于 CK 处理，G+M9Z 处理的粗蛋白含量增加了 49.57%，G+M10 处理增加了 46.84%；胀果甘草的粗蛋白含量与其他处理存在显著差异，相比于 CK 处理，胀果甘草的 G+M9Z 处理粗蛋白含量增加了 37.27%，G+M10 处理增加了 40.33%；在光果甘草中，相比于 CK 处理，G+M9Z 处理存在显著差异，粗蛋白含量增加了 28.14%，G+M10 处理差异不显著，但粗蛋白含量增加了 26.38%。由图1可知，不同处理的 3 种甘草中粗蛋白含量存在显著差异，在 G+M9Z 和 G+M10 处理下，乌拉尔甘草的粗蛋白含量高于胀果甘草、光果甘草，分别较后者提高了 33.33%、26.13% 和 57.26%、56.03%；胀果甘草的粗蛋白含量高于光果甘草，分别提高了 35.9%、40.48%。
图1联合接种对 3 种甘草粗蛋白的影响
注：W 表示乌拉尔甘草，Z 表示胀果甘草，G 表示光果甘草；ns 表示没有显著差异（P>0.05），* 表示差异显著（P<0.05），** 表示差异高度显著（P<0.01），*** 表示差异极显著（P<0.001），**** 表示差异极其显著（P<0.0001）。下同。
2.2 联合接种对不同甘草粗脂肪的影响
由图2可知，3 种甘草在粗脂肪含量上存在差异，不同处理对粗脂肪含量产生了影响。乌拉尔甘草的粗脂肪含量高于其他两种甘草，在联合菌剂的处理下，相比于同处理下的胀果甘草和光果甘草，分别提高了 6.22%、24.4% 和 15.25%、20.55%，胀果甘草的粗脂肪含量在 G+M9Z 处理下也高于光果甘草，增加了 9.63%。乌拉尔甘草的 G+M9Z 和 G+M10 处理与其他处理之间差异极显著，相比于CK 处理，G+M9Z 处理提高了 21.02%，G+M10 处理提高了 31.29%，胀果甘草不同处理间差异显著，与 CK 处理相比，G+M9Z 和 G+M10 处理的粗脂肪含量分别提高了 24.12%、18.11%，光果甘草的 G+M9Z 和 G+M10 处理与 CK 处理相比差异极显著，分别增加了 25.9%、31.24%。
图2联合接种对 3 种甘草粗脂肪的影响
2.3 联合接种对甘草总糖的影响
光果甘草的总糖含量高于其他两种甘草，胀果甘草的总糖含量高于乌拉尔甘草（图3）。G+M9Z 处理的光果甘草总糖含量相较于乌拉尔甘草和胀果甘草分别提高了 4.33%、1.38%，相比于乌拉尔甘草，胀果甘草总糖含量提高了 2.99%；G+M10 处理的光果甘草总糖含量相较于乌拉尔甘草和胀果甘草分别提高了 7.69%、5.41%，相比于乌拉尔甘草，胀果甘草的总糖含量提高了 2.42%。相比于 CK 处理，乌拉尔甘草的 G+M9Z 和 G+M10 处理差异显著，总糖含量分别提高了 21.68%、23.42%，胀果甘草的 G+M9Z 和 G+M10 处理差异显著，总糖含量分别增加了 21.18%、22.48%，光果甘草的 G+M9Z 和 G+M10 处理差异极显著，总糖含量分别提高了 16.41%、21.14%。
图3联合接种对 3 种甘草总糖的影响
2.4 联合接种对甘草总皂苷的影响
由图4可知，不同菌液处理对不同甘草的总皂苷含量积累均有促进作用。乌拉尔甘草 G+M9Z 和 G+M10 处理相比于 CK 处理均有显著促进作用，总皂苷含量分别增加了 25.10%、25.08%；胀果甘草 G+M9Z 处理相比于 CK 处理差异极显著，皂苷含量增加了 34.68%，G+M10 处理相比于 CK 处理差异显著，皂苷含量增加了 31.96%；光果甘草 G+M9Z 和 G+M10 处理相比于 CK 处理均有显著促进作用，总皂苷含量分别增加了 23.50%、36.28%。从图4可看出，胀果甘草的总皂苷含量高于乌拉尔甘草和光果甘草，G+M9Z 和 G+M10 处理分别增加了 29.04%、27.08% 和 25.46%、8.03%，光果甘草总皂苷含量高于乌拉尔甘草，G+M9Z 和 G+M10 处理分别提高了 4.80%、20.72%。
图4联合接种对 3 种甘草总皂苷的影响
2.5 联合接种对甘草黄酮的影响
不同菌液处理对 3 种甘草的黄酮成分均有一定促进作用。与 CK 处理相比，G+M9Z 和 G+M10 处理的乌拉尔甘草黄酮含量均存在显著促进作用，分别增加了 15.87%、22.06%；G+M10 处理与 CK 处理相比，胀果甘草黄酮含量存在极显著差异，提高了 23.84%， G+M9Z 处理与 CK 相比差异显著，提高了 21.64%； 光果甘草的 G+M10 处理黄酮含量存在显著促进作用，提高了 19.14%，G+M9Z 处理与 CK 相比黄酮含量差异不显著，但提高了 16.20%。不同甘草的黄酮含量也存在差异，G+M9Z 处理下，胀果甘草的黄酮含量相比于乌拉尔甘草和光果甘草分别增加了 12.37%、 14.70%，乌拉尔甘草的黄酮含量比光果甘草提高了 2.67%；G+M10 处理下，胀果甘草的黄酮含量相比于乌拉尔甘草和光果甘草分别增加了 8.02%、14.09%，乌拉尔甘草的黄酮含量比光果甘草提高了 6.55%。
图5联合接种对 3 种甘草总黄酮的影响
2.6 联合接种对不同甘草中 5 种组分的相关性分析
2.6.1 联合接种对乌拉尔甘草中不同物质组分间的相关性分析
对乌拉尔甘草中不同组分进行相关性分析，从图6可以看出，粗蛋白与总糖、皂苷、黄酮含量之间存在显著相关性，相关系数分别为 0.59、0.62、 0.80，粗蛋白与粗脂肪之间存在显著相关性，相关系数为 0.59；粗脂肪与总糖和黄酮含量之间存在极显著相关性，相关系数分别为 0.69 和 0.53，粗脂肪与皂苷含量之间存在显著相关性，相关系数为 0.54；总糖与黄酮含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.63；皂苷与黄酮含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.63。
图6联合接种对乌拉尔甘草中不同物质组分间的相关性分析
注：* 表示差异显著（P<0.05），** 表示差异极显著（P<0.01）。下同。
2.6.2 联合接种对胀果甘草中不同物质组分间的相关性分析
对胀果甘草中各组分进行相关分析，由图7可知，胀果甘草中粗蛋白含量与黄酮含量存在极显著相关性，相关系数为 0.72，与粗脂肪、总糖、皂苷含量之间存在显著相关性，相关系数分别为 0.57、 0.69、0.78；粗脂肪与总糖含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.80，粗脂肪与皂苷、黄酮含量之间存在显著相关性，相关系数分别为 0.47、 0.80；总糖与黄酮含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.74，皂苷与黄酮含量之间存在显著相关性，相关系数为 0.59。黄酮和皂苷是甘草中重要的药用成分，与粗蛋白、粗脂肪和总糖之间的显著相关性表明，联合接种可以优化甘草中营养成分的含量，从而提高黄酮和皂苷的含量，达到甘草品质提高的目的。
图7联合接种对胀果甘草中不同物质组分间的相关性分析
2.6.3 联合接种对光果甘草中不同物质组分间的相关性分析
联合接种对光果甘草中不同物质组分间的相关性分析结果见图8。粗蛋白与总糖含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.62，粗蛋白与粗脂肪、黄酮含量之间存在显著相关性，相关系数分别为 0.56、0.55；粗脂肪与总糖、皂苷和黄酮之间存在极显著相关性，相关系数分别为 0.65、0.72、0.66；总糖与皂苷含量之间存在极显著相关性，相关系数为 0.67；皂苷与黄酮之间存在显著相关性，相关系数为 0.55。这也表明甘草的代谢网络是复杂的，这些营养成分在光果甘草的合成和代谢途径中存在一定的关联，为深入研究甘草的代谢网络和调控机制提供了重要的参考依据。
图8联合接种对光果甘草中不同物质组分间的相关性分析
3 讨论
研发新型肥料对提升道地产区人工种植甘草产量与品质极为关键，甘草根部土壤存在丰富的微生物群落，而植物次生代谢产物可作为信号分子，通过影响微生物群落结构及其功能，进而调控植物自身次生代谢产物的合成[23]。蛋白质作为氮源储存，对植物的生长和代谢调控至关重要，舒健虹等[24] 研究表明，根瘤菌（R286-1、R287-3、R310-1、 R325-3） 与内生细菌（R286-5、R287-5） 的复合菌剂能显著提高大豆粗蛋白含量；Liu 等[25]发现，在低温环境下内生菌（Rhizobium rhizolycopersici GUH21）可激活黄酮合成通路，并通过调节根际微生物群落进一步促进黄酮的积累，本研究将根瘤菌与 PGPR 联合接种于 3 种甘草根际，其黄酮含量均显著提高，与上述研究结果一致。郝胜杰等[26]发现，外源硅和丛枝菌根对改善植物生长和增强甘草代谢物积累具有协同作用，本研究中根瘤菌与 PGPR 联合接种对 3 种甘草的代谢产物含量均有一定程度的提高；Movahhed 等[27]研究表明，不同水分胁迫下接种硅和青霉菌（Penicillium spp.） 能提高甘草的总糖含量并改善了脂肪酸的组成， Raklami 等[28]将 PGPR BS17（Acinetobacter sp.）、 PGP27（Rahnella aquatilis）和根瘤菌 RhOF4（Ensifer meliloti）、RhOF155（Ensifer meliloti）联合接种，各复合菌均能提高植物的总糖含量；Shi 等[29] 和 He 等[30] 将混合固氮菌接种甘草，不仅显著提高甘草多糖的含量，黄酮和皂苷的积累也显著提高，本研究未具体探究脂肪酸组成，但联合接种的 3 种甘草的黄酮、皂苷及粗脂肪含量均与空白组有显著差异，与上述研究结论一致。本研究中根瘤菌与 PGPR 联合处理对不同甘草的组分含量相关性分析表明，皂苷和黄酮在甘草中的积累与其他组分的代谢有关，且联合处理能在一定范围内提高甘草代谢物的积累，与丁晓霞[19]研究结果一致。通过试验和结果分析可知，根瘤菌和 PGPR 共同施加能促进甘草生长和有效成分积累，但是由于微生物在田间易受环境压力（温度、湿度、土壤质地）影响，存活率显著低于盆栽[31-32]，若进行大田大规模种植，可考虑采用种子包衣替代灌根或者结合深松耕作方式[31，33]，保证菌液的存活率以达到减少菌液用量的目的，节约成本；还可以采用根浸的方式，将育好的苗根浸后移栽，也可以降低成本，增加菌的成活率并促进苗的生长[34-35]，且目前多数研究仍停留在表型与成分分析，对于联合接种如何提高甘草活性成分含量的基因机制还需深入解析微生物调控甘草代谢的转录组与蛋白组网络。
4 结论
根瘤菌和 PGPR 联合接种对 3 种甘草的活性成分与其对应的 CK 处理相比差异均具有统计学意义。不同的接菌处理对 3 种甘草的粗蛋白、粗脂肪、总糖、总皂苷、黄酮的含量均有提高，但联合接种的各成分与对应的未接菌处理相比，差异显著。因此，微生物联合接种处理为进一步研究和种植高产量、高品质的甘草提供理论基础和技术支持，推动根瘤菌与 PGPR 联合接种在甘草种植中的应用与发展。